Simultaneous manometry and Perkins tonometry were performed at 10.0, 20.0, and 30.0 mm Hg on 15 eyes on which intraocular procedures were performed. There was a statistically significant relationship between corneal thickness and the error of Perkins tonometry. Thin corneas produced underestimations of the intraocular pressure by as much as 4.9 mm Hg, whereas thick corneas produced overestimations by as much as 6.8 mm Hg. Measuring the corneal thickness is necessary to interpret properly the results of Goldmann applanation tonometry, particularly in eyes with thin corneas.

Abstract Inflammatory damage contributes to β-cell failure in type 1 and 2 diabetes (T1D and T2D). Mitochondria are damaged by inflammatory signaling in β-cells, resulting in impaired bioenergetics and initiation of pro-apoptotic machinery. Hence, the identification of protective responses to inflammation could lead to new therapeutic targets. Here we report that mitophagy serves as a protective response to inflammatory stress in both human and rodent β-cells. Utilizing in vivo mitophagy reporters, we observed that diabetogenic pro-inflammatory cytokines induced mitophagy in response to nitrosative/oxidative mitochondrial damage. Mitophagy-deficient β-cells were sensitized to inflammatory stress, leading to the accumulation of fragmented dysfunctional mitochondria, increased β-cell death, and hyperglycemia. Overexpression of CLEC16A , a T1D gene and mitophagy regulator whose expression in islets is protective against T1D, ameliorated cytokine-induced human β-cell apoptosis. Thus, mitophagy promotes β-cell survival and prevents diabetes by countering inflammatory injury. Targeting this pathway has the potential to prevent β-cell failure in diabetes and may be beneficial in other inflammatory conditions.

Abstract Aims/hypothesis Mitochondrial glucose metabolism is essential for stimulated insulin release from pancreatic beta cells. Whether mitochondrial networks may be important for glucose or incretin sensing has yet to be determined. Methods Here, we generated mice with beta cell-selective, adult-restricted deletion of the mitofusin genes Mfn1 and Mfn2 (β Mfn1/2 dKO). Whole or dissociated pancreatic islets were used for live beta cell fluorescence imaging of cytosolic or mitochondrial Ca 2+ concentration and ATP production or GSIS in response to increasing glucose concentrations or GLP-1 receptor agonists. Serum and blood samples were collected to examine oral and i.p. glucose tolerance. Results β Mfn1/2 dKO mice displayed elevated fed and fasted glycaemia (p<0.01, p<0.001) and a >five-fold decrease (p<0.0001) in plasma insulin. Mitochondrial length, glucose-induced polarisation, ATP synthesis and cytosolic Ca 2+ increases were all reduced (p<0.05,p<0.01,p<0.0001) in dKO islets, and beta cell Ca 2+ dynamics were suppressed in vivo (p<0.001). In contrast, oral glucose tolerance was near normal in β Mfn1/2 dKO mice (p<0.05, p<0.01) and GLP-1 or GIP receptor agonists largely corrected defective GSIS from isolated islets through an EPAC-dependent signalling activation. Conclusions/interpretation Mitochondrial fusion and fission cycles are thus essential in the beta cell to maintain normal glucose, but not incretin, sensing. Defects in these cycles in some forms of diabetes might therefore provide opportunities for novel incretin-based or other therapies. Graphical abstract Impact of Mfn1/2 deletion on glucose and incretin stimulated-insulin secretion in beta cells. (A) In control animals, glucose is taken up by beta cells through GLUT2 and metabolised by mitochondria (elongated structure) through the citrate (TCA) cycle, leading to an increased mitochondrial proton motive force (hyperpolarised Δψm), accelerated ATP synthesis and O2 consumption rate (OCR). Consequently, the cytoplasmic ATP:ADP ratio rises, which causes closure of KATP channels, depolarisation of plasma membrane potential (ψm), opening of VDCCs and influx of cytosolic Ca 2+ . Elevated [Ca 2+ ]cyt triggers a number of ATP-dependent processes including insulin secretion and improved beta-beta cell communication through connexin 36 (Cx36). (B) Following Mfn1/2 deletion (β Mfn1/2 dKO), highly fragmented mitochondria were associated with reduced mitochondrial Ca 2+ ([Ca 2+ ]m) accumulation, leading to a less polarised Δψm, weaker OCR, lower mtDNA copy number and decreased ATP synthesis. This is expected to result in weaker ψm depolarisation, cytosolic Ca 2+ influx and beta-beta cell connectivity due to lower expression of Cx36. Despite observing a higher number of docked insulin granules on the plasma membrane, insulin secretion was highly suppressed in these animals. This was also associated with increased beta cell death and reduced beta cell mass. (C) In response to incretins, insulin secretion is potentiated through the activation of GLP1-R and cAMP signalling involving PKA- and EPAC2-dependent pathways. Elevated [Ca 2+ ]cyt triggers a number of ATP-dependent processes including insulin secretion and Ca2+ removal into the endoplasmic reticulum (ER).(D) In β Mfn1/2 dKO cells, activation of the GLP1-R was shown to be linked with a potentiation of the EPAC2 pathway that is PKA independent, along with an increased ER Ca 2+ uptake and improved beta-beta cell communication. How these ‘amplifying’ signals of glucose metabolism for insulin secretion are linked with fragmented mitochondria remains unknown. Red and bold arrows represent enhanced pathways; dashed arrows represent impaired pathways. This figure was produced using illustrations from Servier Medical Art, http://smart.servier.com/ Research in context What is already known about this subject? Mitochondrial ultrastructural variations and number are altered in beta cells of human T2D patients [1]. Mice lacking Opa1 , which controls mitochondrial fusion and inner membrane cristae structure, in beta cells, develop hyperglycaemia and defects in GSIS [2]. What is the key question? Is an interconnected mitochondrial network essential in primary mouse beta cells for normal insulin secretion and glucose homeostasis? What are the new findings? We generated mice with beta cell-selective, adult-restricted deletion of the mitofusin genes Mfn1 and Mfn2 and show that insulin secretion and glucose homeostasis are strongly reduced in vivo . Cytosolic and mitochondrial Ca 2+ increases, Δψ m , ATP production and beta cell connectivity are impaired in β Mfn1/2 dKO animals. Incretins bypass the above defects through an exchange protein directly activated by cAMP (EPAC)-dependent signalling mechanism. How might this impact on clinical practice in the foreseeable future? The ability of incretins to bypass defects in mitochondrial function might be exploited by the design of new agonists which target this pathway.

ABSTRACT The dynamin-like GTPases Mitofusin 1 and 2 (Mfn1 and Mfn2) are essential for mitochondrial function, which has been principally attributed to their regulation of fission/fusion dynamics. Here, we report that Mfn1 and 2 are critical for glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) primarily through control of mitochondrial DNA (mtDNA) content. Whereas Mfn1 and Mfn2 individually were dispensable for glucose homeostasis, combined Mfn1/2 deletion in β-cells reduced mtDNA content, impaired mitochondrial morphology and networking, and decreased respiratory function, ultimately resulting in severe glucose intolerance. Importantly, gene dosage studies unexpectedly revealed that Mfn1/2 control of glucose homeostasis was dependent on maintenance of mtDNA content, rather than mitochondrial structure. Mfn1/2 maintain mtDNA content by regulating the expression of the crucial mitochondrial transcription factor Tfam, as Tfam overexpression ameliorated the reduction in mtDNA content and GSIS in Mfn1/2-deficient β-cells. Thus, the primary physiologic role of Mfn1 and 2 in β-cells is coupled to the preservation of mtDNA content rather than mitochondrial architecture, and Mfn1 and 2 may be promising targets to overcome mitochondrial dysfunction and restore glucose control in diabetes.

ABSTRACT CLEC16A regulates mitochondrial health through mitophagy and is associated with over 20 human diseases. While CLEC16A has ubiquitin ligase activity, the key structural and functional regions of CLEC16A, and their relevance for human disease, remain unknown. Here, we report that a disease-associated CLEC16A variant lacks a C-terminal intrinsically disordered protein region (IDPR) that is critical for mitochondrial quality control. Using carbon detect NMR, we find that the CLEC16A C terminus lacks secondary structure, validating the presence of an IDPR. Loss of the CLEC16A C-terminal IDPR in vivo impairs pancreatic β-cell mitophagy, mitochondrial function, and glucose-stimulated insulin secretion, ultimately causing glucose intolerance. Deletion of the CLEC16A C-terminal IDPR increases its self-ubiquitination and destabilizes CLEC16A, thus impairing formation of a critical CLEC16A-dependent mitophagy complex. Importantly, CLEC16A stability is dependent on proline bias within the C-terminal IDPR, but not amino acid sequence order or charge. Together, we clarify how an IDPR in CLEC16A prevents diabetes, thus implicating the disruption of IDPRs as novel pathological contributors to diabetes and other CLEC16A-associated diseases.

Type 2 diabetes (T2D) is a metainflammatory disease characterized by impairments in mitochondrial function and ultrastructure that contribute to the overall disruption of β-cell function. Mitochondria rely on both the nuclear genome as well as their own 16.6 kilobase-pair circular genome to generate the machinery required for oxidative phosphorylation (OXPHOS). Recently, our group identified a reduction in mitochondrial DNA (mtDNA) copy number in islets from donors with T2D, indicating a disruption in mitochondrial genome stability. While mtDNA genome instability is implicated in several diseases, its impact on β-cell dysfunction in diabetes has yet to be explored. Here, we generated a mouse model prone to increased β-cell mtDNA deletions by selective expression of a dominant negative Twinkle (TwnkK320E) helicase mutant, which is essential for mtDNA maintenance. Beginning at 5 weeks, β-TwnkK320E mice exhibited impaired glucose tolerance, which progressively worsened with age. Circulating insulin concentrations following glucose stimulation were also reduced in β-TwnkK320E mice by 5 weeks of age, yet there was no difference in β-cell mass, suggestive of a β cell functional defect. Further, we observed a complete loss of MafA, a key regulator of β-cell maturity, from a subset of β cells in β-TwnkK320E mice. While mitochondrial mass was unchanged between groups, β‑TwnkK320E islets have altered expression of subunits of all OXPHOS complexes, as well as reduced glucose-stimulated oxygen consumption, indicative of impaired mitochondrial function. Together, these data suggest that the accumulation of mtDNA deletions diminishes β-cell function and support the importance of mitochondrial genome integrity to β-cell health. Disclosure R.K. Davidson: Employee; Eli Lilly and Company. J. Zhu: None. E.C. Reck: None. S. Soleimanpour: Advisory Panel; Novo Nordisk. Research Support; Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Funding National Institutes of Health (T32DK101357)

ABSTRACT MAFA and MAFB are related basic-leucine-zipper domain containing transcription factors which have important overlapping and distinct regulatory roles in a variety of cellular contexts, including hormone production in pancreatic islet α and β cells. Here we first examined how mutating conserved MAF protein-DNA contacts obtained from X-ray crystal structure analysis impacted their DNA-binding and Insulin enhancer-driven activity. While most of these interactions were essential and their disruption severely compromised activity, we identified that regions outside of the contact areas also contributed to activity. AlphaFold 2, an artificial intelligence-based structural prediction program, was next used to determine if there were also differences in the three-dimensional organization of the non-DNA binding/dimerization sequences of MAFA and MAFB. This analysis was conducted on the wildtype (WT) proteins as well as the pathogenic MAFA Ser64Phe and MAFB Ser70Ala trans -activation domain mutants, with differences revealed between MAFA WT and MAFB WT as well as between MAFA Ser64Phe and MAFA WT , but not between MAFB Ser70Ala and MAFB WT . Moreover, dissimilarities between these proteins were also observed in their ability to cooperatively stimulate Insulin enhancer-driven activity in the presence of other islet-enriched transcription factors. Analysis of MAFA and MAFB chimeras disclosed that these properties were greatly influenced by unique C-terminal region structural differences predicted by AlphaFold 2. Importantly, these results have revealed features of these closely related proteins that are functionally significant in islet biology.

Accumulating evidence indicates that type 2 diabetes (T2D) is a protein misfolding disease. LonP1 is an essential mitochondrial protease that mediates mitochondrial proteostasis through clearance of unfolded or misfolded proteins, but its role in β-cells is unknown. We generated mice bearing β-cell specific deletion of LonP1 (β-LonP1KO) and found that LonP1 deletion led to progressively impaired glucose tolerance with age and decreased glucose-stimulated insulin release (GSIS). LonP1 deficiency also induced β-cell apoptosis resulting in the loss of β-cell mass. In the mitochondria, β-LonP1KO mice exhibited diminished mitochondrial respiration, abnormal mitochondrial ultrastructure, reduced mitochondrial mass, and elevated ROS levels. An accumulation of misfolded mitochondrial proteins, defect of OXPHOS complex assembly, and/or induction of ROS could be primary triggers driving mitochondrial dysfunction and β-cell apoptosis in β-LonP1KO islets. Interestingly, β-cell specific overexpression of the antioxidant enzyme catalase targeted to mitochondria exerted only a modest, transient protective effect on glucose tolerance and β-cell mass in β-LonP1KO mice yet did not relieve accumulation of misfolded mitochondrial proteins, suggesting ROS alone could not account for the phenotype in LonP1-deficient mice. Concordantly, a similar effect of anti-oxidants on β-cell survival and mitochondrial protein misfolding was observed in human islets in the context of LonP1-deficiency. Thus, the LonP1 protease is vital for β-cell survival and mass by governing mitochondrial protein folding, which could be a potential therapeutic target to prevent β-cell failure during the development of T2D. Disclosure J. Li: None. J. Zhu: None. E.C. Reck: None. E.M. Walker: None. S. Soleimanpour: Advisory Panel; Novo Nordisk. Research Support; Ono Pharmaceutical Co., Ltd.

ABSTRACT Mitochondrial damage is a hallmark of metabolic diseases, including diabetes and metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, yet the consequences of impaired mitochondria in metabolic tissues are often unclear. Here, we report that dysfunctional mitochondrial quality control engages a retrograde (mitonuclear) signaling program that impairs cellular identity and maturity across multiple metabolic tissues. Surprisingly, we demonstrate that defects in the mitochondrial quality control machinery, which we observe in pancreatic β cells of humans with type 2 diabetes, cause reductions of β cell mass due to dedifferentiation, rather than apoptosis. Utilizing transcriptomic profiling, lineage tracing, and assessments of chromatin accessibility, we find that targeted deficiency anywhere in the mitochondrial quality control pathway ( e.g. , genome integrity, dynamics, or turnover) activate the mitochondrial integrated stress response and promote cellular immaturity in β cells, hepatocytes, and brown adipocytes. Intriguingly, pharmacologic blockade of mitochondrial retrograde signaling in vivo restores β cell mass and identity to ameliorate hyperglycemia following mitochondrial damage. Thus, we observe that a shared mitochondrial retrograde response controls cellular identity across metabolic tissues and may be a promising target to treat or prevent metabolic disorders.

Abstract A central goal of physiological research is the understanding of cell-specific roles of disease-associated genes. Cre-mediated recombineering is the tool of choice for cell type-specific analysis of gene function in pre-clinical models. In the type 1 diabetes research field, multiple lines of NOD mice have been engineered to express Cre recombinase in pancreatic β-cells using insulin promoter fragments, but tissue promiscuity remains a concern. Constitutive Ins1 tm1.1(cre)Thor ( Ins1 Cre ) mice on the C57/bl6-J background has high β-cell specificity and with no reported off-target effects. We explored if NOD: Ins1 Cre mice could be used to investigate β-cell gene deletion in type 1 diabetes disease modeling. We studied wildtype ( Ins1 WT/WT ), Ins1 heterozygous ( Ins1 Cre/WT or Ins1 Neo/WT ), and Ins1 null ( Ins1 Cre/Neo ) littermates on a NOD background. Female Ins1 Neo/WT mice exhibited significant protection from diabetes, with further near-complete protection in Ins1 Cre/WT mice. The effects of combined neomycin and Cre knock-in in Ins1 Neo/Cre mice were not additive to the Cre knock-in alone. In Ins1 Neo/Cre mice, protection from diabetes was associated with reduced insulitis at 12 weeks of age. Collectively, these data confirm previous reports that loss of Ins1 alleles protects NOD mice from diabetes development and demonstrates, for the first time, that Cre itself may have additional protective effects. This has significant implications for the experimental design and interpretation of pre-clinical type 1 diabetes studies using β-cell-specific Cre in NOD mice.