Following some high-profile clinical trial failures in recent years, the emphasis in HIV/AIDS vaccine research has shifted away from T-cell-based vaccines that control viral replication towards vaccines that block acquisition of infection. Hansen et al. take a novel route to T-cell-based immunity, using cytomegalovirus (CMV) vectors. They find that vaccination with a rhesus-CMV-based vaccine against simian immunodeficiency virus (SIV) provides long-term protection from SIV challenge in rhesus macaques. Protection seems to be mediated by tissue-resident T-effector memory responses, suggesting that persistent vectors such as CMV may be effective in HIV/AIDS vaccines. The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)-causing lentiviruses human immunodeficiency virus (HIV) and simian immunodeficiency virus (SIV) effectively evade host immunity and, once established, infections with these viruses are only rarely controlled by immunological mechanisms1,2,3. However, the initial establishment of infection in the first few days after mucosal exposure, before viral dissemination and massive replication, may be more vulnerable to immune control4. Here we report that SIV vaccines that include rhesus cytomegalovirus (RhCMV) vectors5 establish indefinitely persistent, high-frequency, SIV-specific effector memory T-cell (TEM) responses at potential sites of SIV replication in rhesus macaques and stringently control highly pathogenic SIVMAC239 infection early after mucosal challenge. Thirteen of twenty-four rhesus macaques receiving either RhCMV vectors alone or RhCMV vectors followed by adenovirus 5 (Ad5) vectors (versus 0 of 9 DNA/Ad5-vaccinated rhesus macaques) manifested early complete control of SIV (undetectable plasma virus), and in twelve of these thirteen animals we observed long-term (≥1 year) protection. This was characterized by: occasional blips of plasma viraemia that ultimately waned; predominantly undetectable cell-associated viral load in blood and lymph node mononuclear cells; no depletion of effector-site CD4+ memory T cells; no induction or boosting of SIV Env-specific antibodies; and induction and then loss of T-cell responses to an SIV protein (Vif) not included in the RhCMV vectors. Protection correlated with the magnitude of the peak SIV-specific CD8+ T-cell responses in the vaccine phase, and occurred without anamnestic T-cell responses. Remarkably, long-term RhCMV vector-associated SIV control was insensitive to either CD8+ or CD4+ lymphocyte depletion and, at necropsy, cell-associated SIV was only occasionally measurable at the limit of detection with ultrasensitive assays, observations that indicate the possibility of eventual viral clearance. Thus, persistent vectors such as CMV and their associated TEM responses might significantly contribute to an efficacious HIV/AIDS vaccine.

Cellular immune responses in rhesus macaques (Macaca mulatta) vaccinated with cytomegalovirus vectors expressing SIV proteins are able to stringently control highly pathogenic SIV infection, regardless of the route of challenge, after systemic spread; immunological and virological analyses of protected macaques followed for up to 3 years suggest that persistent immune surveillance by vaccine-elicited immune responses may have cleared the infection. Work on potential vaccines against human immunodeficiency viruses (HIV) and the simian equivalent (SIV) has so far proved largely fruitless. This study makes some progress by exploiting the recent observation that the pathogens appear vulnerable to immune control or pharmacological clearance in the first few hours to days of infection. Rhesus macaques vaccinated with SIV protein-expressing rhesus cytomegalovirus (RhCMV/SIV) vectors developed durable resistance to the highly pathogenic SIVmac239 after challenge by vaginal and intravenous routes. Some of the vaccinated animals have controlled viral replication for 1 to 3 years with no demonstrable evidence for residual virus, raising the possibility that the vaccine- elicited immune responses may in fact have cleared the initial infection. Established infections with the human and simian immunodeficiency viruses (HIV and SIV, respectively) are thought to be permanent with even the most effective immune responses and antiretroviral therapies only able to control, but not clear, these infections1,2,3,4. Whether the residual virus that maintains these infections is vulnerable to clearance is a question of central importance to the future management of millions of HIV-infected individuals. We recently reported that approximately 50% of rhesus macaques (RM; Macaca mulatta) vaccinated with SIV protein-expressing rhesus cytomegalovirus (RhCMV/SIV) vectors manifest durable, aviraemic control of infection with the highly pathogenic strain SIVmac239 (ref. 5). Here we show that regardless of the route of challenge, RhCMV/SIV vector-elicited immune responses control SIVmac239 after demonstrable lymphatic and haematogenous viral dissemination, and that replication-competent SIV persists in several sites for weeks to months. Over time, however, protected RM lost signs of SIV infection, showing a consistent lack of measurable plasma- or tissue-associated virus using ultrasensitive assays, and a loss of T-cell reactivity to SIV determinants not in the vaccine. Extensive ultrasensitive quantitative PCR and quantitative PCR with reverse transcription analyses of tissues from RhCMV/SIV vector-protected RM necropsied 69–172 weeks after challenge did not detect SIV RNA or DNA sequences above background levels, and replication-competent SIV was not detected in these RM by extensive co-culture analysis of tissues or by adoptive transfer of 60 million haematolymphoid cells to naive RM. These data provide compelling evidence for progressive clearance of a pathogenic lentiviral infection, and suggest that some lentiviral reservoirs may be susceptible to the continuous effector memory T-cell-mediated immune surveillance elicited and maintained by cytomegalovirus vectors.

CMV Breaks All the Rules One vaccine strategy being pursued against HIV is to generate protection that is dependent on cell-mediated, rather than humoral, immune responses. A cytomegalovirus (CMV)–vectored vaccine that expresses simian immunodeficiency virus (SIV) antigens exhibits stringent and durable viral control upon SIV challenge in approximately half of vaccinated rhesus macaques. Hansen et al. ( 10.1126/science.1237874 , see the Perspective by Goonetilleke and McMichael ) sought to determine the basis for the protection and discovered that the CD8 + T cell response in vaccinated monkeys does not target canonical SIV epitopes, which SIV is known to escape, but rather generates a broad, promiscuous response.

Abstract Strain 68-1 rhesus cytomegalovirus (RhCMV) vectors expressing simian immunodeficiency virus (SIV) antigens elicit CD8 + T cells that recognize peptide epitopes presented by major histocompatibility complex (MHC)-II and MHC-E molecules, instead of MHC-Ia, and are uniquely able to mediate stringent control and subsequent clearance of highly pathogenic SIV in ∼50% of vaccinated rhesus macaques (RMs). We show that the MHC-E ligand VMAPRTLLL (VL9), encoded by the Rh67 gene (or its HCMV UL40 counterpart) is required for recognition of RhCMV-infected fibroblasts by MHC-E-restricted CD8 + T cells via its ability to promote intracellular MHC-E transport. Moreover, deletion of Rh67 from 68-1 RhCMV/SIV vectors, or mutation of its embedded VL9 ligand, abrogated induction of MHC-E-restricted CD8 + T cell responses, leaving responses that exclusively target MHC-II-restricted epitopes. These MHC-II-presented CD8 + T cell responses, though comparable in response magnitude and functional differentiation to responses arising from the efficacious 68-1 vector, did not protect RMs against SIV challenge, indicating that Rh67/UL40-enabled direct priming of MHC-E-targeted CD8 + T cells is a crucial element of RhCMV/SIV vaccine efficacy. One Sentence Summary A cytomegalovirus protein (Rh67/UL40) that upregulates MHC-E expression on RhCMV/SIV-vector infected cells is required for induction of MHC-E-restricted CD8 + T cells and for protection against SIV.

Abstract Simian immunodeficiency virus (SIV) insert-expressing, 68-1 Rhesus Cytomegalovirus (RhCMV/SIV) vectors elicit major histocompatibility complex (MHC)-E- and -II-restricted, SIV-specific CD8 + T cell responses, but the basis of these unconventional responses and their contribution to demonstrated vaccine efficacy against SIV challenge in the rhesus monkeys (RMs) has not been characterized. We demonstrate that these unconventional responses resulted from a chance genetic rearrangement in 68-1 RhCMV that abrogated the function of eight distinct immunomodulatory gene products encoded in two RhCMV genomic regions (Rh157.5/.4 and Rh158-161). Differential repair of these genes with either RhCMV-derived or orthologous human CMV (HCMV)-derived sequences (UL128/130; UL146/147) leads to either of two distinct CD8 + T cell response types – MHC-Ia-restricted-only, or a mix of MHC-II- and MHC-Ia-restricted CD8 + T cells. Despite response magnitude and functional differentiation being similar to RhCMV 68-1, neither alternative response type mediated protection against SIV challenge. These findings implicate MHC-E-restricted CD8 + T cell responses as mediators of anti-SIV efficacy and indicate that translation of RhCMV/SIV vector efficacy to humans will likely require deletion of all the genes that inhibit these responses from the HCMV/HIV vector. One-sentence summary Eight genes in two spatially distinct RhCMV gene regions control induction of unconventionally restricted CD8 + T cell responses and the efficacy of RhCMV/SIV vaccine vectors against SIV challenge.

Abstract Simian immunodeficiency virus (SIV) challenge of rhesus macaques (RMs) vaccinated with Rhesus Cytomegalovirus (RhCMV) vectors expressing SIV proteins (RhCMV/SIV) results in a binary outcome: stringent control and subsequent clearance of highly pathogenic SIV in ~55% of vaccinated RMs with no protection in the remaining 45%. Although previous work suggests that unconventionally restricted, SIV-specific, effector-memory (EM)-biased CD8 + T cell responses are necessary for efficacy, the magnitude of these responses does not predict efficacy, and the basis of protection vs. non-protection in RhCMV/SIV vector-vaccinated RMs has not been elucidated. Here, we report that RhCMV/SIV vector administration strikingly alters the whole blood transcriptome of vaccinated RMs, with the sustained induction of specific immune-related pathways, including non-canonical T cell receptor (TCR), toll-lie receptor (TLR), inflammasome/cell death, and interleukin-15 (IL-15) signaling, significantly predicting protection. The IL-15 gene expression signature was further evaluated in an independent RM IL-15 treatment cohort, revealing that in whole blood the response to IL-15 is inclusive of innate and adaptive immune gene expression networks that link with RhCMV/SIV vaccine efficacy. We also show that this IL-15 response signature similarly tracks with vaccine protection in an independent RhCMV/SIV vaccination/SIV challenge RM validation cohort. Thus, the RhCMV/SIV vaccine imparts a coordinated and persistent induction of innate and adaptive immune pathways featuring IL-15, a known regulator of CD8 + T cell function, that enable vaccine-elicited CD8 + T cells to mediate protection against highly pathogenic SIV challenge. Author Summary SIV insert-expressing vaccine vectors based on strain 68-1 RhCMV elicit robust, highly effector-memory-biased T cell responses that are associated with an unprecedented level of SIV control after challenge (replication arrest leading to clearance) in slightly over half of vaccinated monkeys. Since efficacy is not predicted by standard measures of immunogenicity, we used functional genomics analysis of RhCMV/SIV vaccinated monkeys with known challenge outcomes to identify immune correlates of protection. We found that arrest of viral replication after challenge significantly correlates with a vaccine-induced response to IL-15 that includes modulation of T cell, inflammation, TLR signaling, and cell death programming. These data suggest that RhCMV/SIV efficacy is not based on chance, but rather, results from a coordinated and sustained vaccine-mediated induction of innate and adaptive immune pathways featuring IL-15, a known regulator of CD8 + effector-memory T cell function, that enable vaccine-elicited CD8 + T cells to mediate efficacy.

Abstract Cytomegaloviruses (CMVs) are highly adapted to their host species resulting in strict species specificity. Hence, in vivo examination of all aspects of CMV biology employs animal models using host-specific CMVs. Infection of rhesus macaques (RM) with rhesus CMV (RhCMV) has been established as a representative model for infection of humans with HCMV due to the close evolutionary relationships of both host and virus. However, the commonly used 68-1 strain of RhCMV has been passaged in fibroblasts for decades resulting in multiple genomic changes due to tissue culture adaptation that cause reduced viremia in RhCMV-naïve animals and limited shedding compared to low passage isolates. Using sequence information from primary RhCMV isolates we constructed a full-length (FL) RhCMV by repairing all presumed mutations in the 68-1 bacterial artificial chromosome (BAC). Inoculation of adult, immunocompetent, RhCMV-naïve RM with the reconstituted virus resulted in significant replication in the blood similar to primary isolates of RhCMV and furthermore led to extensive viremia in many tissues at day 14 post infection. In contrast, viral dissemination and viremia was greatly reduced upon deletion of genes also lacking in 68-1. Transcriptome analysis of infected tissues further revealed that chemokine-like genes deleted in 68-1 are among the most highly expressed viral transcripts both in vitro and in vivo consistent with an important immunomodulatory function of the respective proteins. We conclude that FL-RhCMV displays in vitro and in vivo characteristics of a wildtype virus while being amenable to genetic modifications through BAC recombineering techniques. Author Summary Human cytomegalovirus (HCMV) infections are generally asymptomatic in healthy immunocompetent individuals, but HCMV can cause serious disease after congenital infection and in individuals with immunocompromised immune systems. Since HCMV is highly species specific and cannot productively infect immunocompetent laboratory animals, experimental infection of rhesus macaques (RM) with rhesus CMV (RhCMV) has been established as a closely related animal model for HCMV. By employing the unique ability of CMV to elicit robust and lasting cellular immunity, this model has also been instrumental in developing novel CMV-based vaccines against chronic and recurring infections with pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV) and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) . However, most of this work was conducted with derivatives of the 68-1 strain of RhCMV which has acquired multiple genomic alterations in tissue culture. To model pathogenesis and immunology of clinical HCMV isolates we generated a full-length (FL) RhCMV clone representative of low passage isolates. Infection of RhCMV-naïve RM with FL-RhCMV demonstrated viremia and tissue dissemination that was comparable to that of non-clonal low passage isolates. We further demonstrate that FL-RhCMV is strongly attenuated upon deletion of gene regions absent in 68-1 thus demonstrating the usefulness of FL-RhCMV to study RhCMV pathogenesis.