MicroRNAs (miRNAs) play critical roles in development, and dysregulation of miRNA expression has been observed in human malignancies. Recent evidence suggests that the processing of several primary miRNA transcripts (pri-miRNAs) is blocked posttranscriptionally in embryonic stem cells, embryonal carcinoma cells, and primary tumors. Here we show that Lin28, a developmentally regulated RNA binding protein, selectively blocks the processing of pri-let-7 miRNAs in embryonic cells. Using in vitro and in vivo studies, we found that Lin28 is necessary and sufficient for blocking Microprocessor-mediated cleavage of pri-let-7 miRNAs. Our results identify Lin28 as a negative regulator of miRNA biogenesis and suggest that Lin28 may play a central role in blocking miRNA-mediated differentiation in stem cells and in certain cancers.

Therapy-resistant cancer cell states identified across diverse contexts are selectively vulnerable to ferroptotic cell death induced by inhibition of lipid peroxidase pathways converging on GPX4. Cancer cells can assume different biological states, which can affect their resistance to therapies. A mesenchymal phenotype has been associated with drug resistance but the mechanism behind this state is not well understood. Stuart Schreiber and colleagues now show that tumour cells with a mesenchymal phenotype are selectively sensitive to inhibition of GPX4, an enzyme that alters lipid metabolism. GPX4 dissipates lipid peroxides and therefore prevents the iron-mediated reactions which induce ferroptotic cell death. These findings offer new perspectives on targeting cancers that have undergone a transition to a mesenchymal state to evade other therapeutic agents. Plasticity of the cell state has been proposed to drive resistance to multiple classes of cancer therapies, thereby limiting their effectiveness1,2,3,4. A high-mesenchymal cell state observed in human tumours and cancer cell lines has been associated with resistance to multiple treatment modalities across diverse cancer lineages, but the mechanistic underpinning for this state has remained incompletely understood1,2,3,4,5,6. Here we molecularly characterize this therapy-resistant high-mesenchymal cell state in human cancer cell lines and organoids and show that it depends on a druggable lipid-peroxidase pathway that protects against ferroptosis, a non-apoptotic form of cell death induced by the build-up of toxic lipid peroxides7,8. We show that this cell state is characterized by activity of enzymes that promote the synthesis of polyunsaturated lipids. These lipids are the substrates for lipid peroxidation by lipoxygenase enzymes8,9. This lipid metabolism creates a dependency on pathways converging on the phospholipid glutathione peroxidase (GPX4), a selenocysteine-containing enzyme that dissipates lipid peroxides and thereby prevents the iron-mediated reactions of peroxides that induce ferroptotic cell death8. Dependency on GPX4 was found to exist across diverse therapy-resistant states characterized by high expression of ZEB1, including epithelial–mesenchymal transition in epithelial-derived carcinomas, TGFβ-mediated therapy-resistance in melanoma, treatment-induced neuroendocrine transdifferentiation in prostate cancer, and sarcomas, which are fixed in a mesenchymal state owing to their cells of origin. We identify vulnerability to ferroptic cell death induced by inhibition of a lipid peroxidase pathway as a feature of therapy-resistant cancer cells across diverse mesenchymal cell-state contexts.

George Daley and colleagues show that Lin28 and Lin28B promote cellular transformation by repressing let-7 family members, leading to derepression of let-7 targets. They also find that LIN28 and LIN28B are overexpressed in ∼15% of primary human tumors and cancer cell lines and that their expression is associated with aggressive disease and poor prognosis across multiple tumor types. Multiple members of the let-7 family of miRNAs are often repressed in human cancers1,2, thereby promoting oncogenesis by derepressing targets such as HMGA2, K-Ras and c-Myc3,4. However, the mechanism by which let-7 miRNAs are coordinately repressed is unclear. The RNA-binding proteins LIN28 and LIN28B block let-7 precursors from being processed to mature miRNAs5,6,7,8, suggesting that their overexpression might promote malignancy through repression of let-7. Here we show that LIN28 and LIN28B are overexpressed in primary human tumors and human cancer cell lines (overall frequency ∼15%), and that overexpression is linked to repression of let-7 family miRNAs and derepression of let-7 targets. LIN28 and LIN28b facilitate cellular transformation in vitro, and overexpression is associated with advanced disease across multiple tumor types. Our work provides a mechanism for the coordinate repression of let-7 miRNAs observed in a subset of human cancers, and associates activation of LIN28 and LIN28B with poor clinical prognosis.

Summary

Background

 Among the syndromes characterised by thrombotic microangiopathy, thrombotic thrombocytopenic purpura is distinguished by a severe deficiency in the ADAMTS13 enzyme. Patients with this disorder need urgent treatment with plasma exchange. Because ADAMTS13 activity testing typically requires prolonged turnaround times and might be unavailable in resource-poor settings, a method to rapidly assess the likelihood of severe ADAMTS13 deficiency is needed. 

Methods

 All consecutive adult patients presenting to three large academic medical centres in Boston, MA, USA, with thrombotic microangiopathy and a possible diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura between Jan 8, 2004, and Dec 6, 2015, were included in an ongoing multi-institutional registry (the Harvard TMA Research Collaborative). Univariate analysis was used to identify covariates for a logistic regression model predictive of severe ADAMTS13 deficiency (≤10% activity). A clinical point score was generated, and its diagnostic performance was assessed using internal and external validation cohorts and compared to clinical assessment alone. 

Findings

 214 patients with thrombotic microangiopathy were included in the derivation cohort. A seven-component clinical prediction tool, termed the PLASMIC score, was developed and found to reliably assess the pretest probability of severe ADAMTS13 deficiency (C statistic 0·96, 95% CI 0·92–0·98). Our diagnostic model was reproducibly accurate in both the internal (0·95, 0·91–0·98) and external (0·91, 0·85–0·95) validation cohorts. The scoring system also more consistently diagnosed thrombotic microangiopathy due to severe ADAMTS13 deficiency than did standard clinical assessment, as measured by C statistic (0·96, 95% CI 0·92–0·98 for PLASMIC vs 0·83, 0·77–0·88 for clinical assessment; p<0·0001) and mean Brier score (0·065 for PLASMIC vs 0·111 for clinical assessment; mean paired difference 0·05, 95% CI 0·01–0·08; p<0·0001). When utilised in addition to clinical assessment, the PLASMIC score contributed significant discriminatory power (integrated discrimination improvement 0·24, 95% CI 0·11–0·37). 

Interpretation

 We have developed and validated a clinical prediction tool—the PLASMIC score—to stratify patients with thrombotic microangiopathy according to their risk of having severe ADAMTS13 deficiency. We have shown that this scoring system is superior to standard clinical assessment in addressing the diagnostic challenge presented by thrombotic microangiopathy. Its use, together with clinical judgment, may facilitate treatment decisions in patients for whom timely results of ADAMTS13 activity testing are unavailable. 

Funding

 The Luick Family Fund of Massachusetts General Hospital.

Lin28, a highly conserved RNA-binding protein, has emerged as a modulator of the processing of the let-7 microRNA. This role for Lin28 has important implications for our mechanistic understanding of pluripotency, the timing of development, and oncogenesis. Lin28, a highly conserved RNA-binding protein, has emerged as a modulator of the processing of the let-7 microRNA. This role for Lin28 has important implications for our mechanistic understanding of pluripotency, the timing of development, and oncogenesis. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small RNAs with diverse regulatory roles. The discovery of miRNAs and closely related small-interfering RNAs (siRNAs) is a watershed moment in biology that has changed traditional views of genetic regulation and has placed small RNAs alongside transcription factors as critical regulators of gene expression. But what regulates these regulators? Recent studies indicate that miRNA biogenesis can be posttranscriptionally regulated by trans-acting factors. The Lin28/let-7 partnership is the best characterized example of the relationship between an miRNA and its posttranscriptional regulator and may shed light on the posttranscriptional regulation of other miRNAs. Here, we highlight recent advances in our understanding of the posttranscriptional regulation of the let-7 miRNA by the conserved RNA-binding protein Lin28 and show how this impacts our understanding of pluripotency, development, and cancer. Lin28 was first characterized in the nematode Caenorhabditis elegans as an important regulator of developmental timing (Ambros and Horvitz, 1984Ambros V. Horvitz H.R. Science. 1984; 226: 409-416Crossref PubMed Scopus (539) Google Scholar, Moss et al., 1997Moss E.G. Lee R.C. Ambros V. Cell. 1997; 88: 637-646Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (655) Google Scholar). Mutations in the lin-28 gene and in other so-called "heterochronic genes" perturb developmental progression in the worm, such that characteristic events occur either earlier or later than normal. The mammalian homologs of lin-28, Lin28 and Lin28b, bind to the terminal loops of the precursors of let-7 family miRNAs and block their processing into mature miRNAs (Heo et al., 2008Heo I. Joo C. Cho J. Ha M. Han J. Kim V.N. Mol. Cell. 2008; 32: 276-284Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (736) Google Scholar, Newman et al., 2008Newman M.A. Thomson J.M. Hammond S.M. RNA. 2008; 14: 1539-1549Crossref PubMed Scopus (568) Google Scholar, Rybak et al., 2008Rybak A. Fuchs H. Smirnova L. Brandt C. Pohl E.E. Nitsch R. Wulczyn F.G. Nat. Cell Biol. 2008; 10: 987-993Crossref PubMed Scopus (626) Google Scholar, Viswanathan et al., 2008Viswanathan S.R. Daley G.Q. Gregory R.I. Science. 2008; 320: 97-100Crossref PubMed Scopus (1133) Google Scholar, Piskounova et al., 2008Piskounova E. Viswanathan S.R. Janas M. LaPierre R.J. Daley G.Q. Sliz P. Gregory R.I. J. Biol. Chem. 2008; 283: 21310-21314Crossref PubMed Scopus (274) Google Scholar). Interestingly, let-7 is itself a heterochronic gene in the worm, suggesting that the interaction between Lin28 and let-7 is important for regulating the timing of development. Both lin-28 and let-7 are highly conserved across evolution (Moss et al., 1997Moss E.G. Lee R.C. Ambros V. Cell. 1997; 88: 637-646Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (655) Google Scholar, Pasquinelli et al., 2000Pasquinelli A.E. Reinhart B.J. Slack F. Martindale M.Q. Kuroda M.I. Maller B. Hayward D.C. Ball E.E. Degnan B. Muller P. et al.Nature. 2000; 408: 86-89Crossref PubMed Scopus (1735) Google Scholar), and recent data are beginning to uncover roles for Lin28 in mammalian development. Several groups have reported the reprogramming of adult human fibroblasts to induced pluripotent stem (iPS) cells using the same combination of factors (OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC) originally discovered and used by Shinya Yamanaka to reprogram mouse fibroblasts back to a pluripotent state. However, James Thomson's group created iPS cells from adult human fibroblasts using a slightly different cocktail of factors: OCT4, SOX2, NANOG, and LIN28 (reviewed in Yamanaka, 2008Yamanaka S. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2008; 363: 2079-2087Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar). Together with recent evidence that Lin28 represses the processing of a let-7 precursor into the mature let-7 miRNA, this raises the tantalizing possibility that repression of let-7 is important in establishing the pluripotent state. In support of this notion, the let-7 miRNA is present in low amounts or is absent in a variety of different stem and progenitor cell populations. Furthermore, as organisms age, the self-renewal capacity of their neural stem cells declines, apparently due to an increase in let-7 and a corresponding decrease in the expression of HMGA2, a target gene that is silenced by let-7 (Nishino et al., 2008Nishino J. Kim I. Chada K. Morrison S.J. Cell. 2008; 135: 227-239Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (468) Google Scholar). Mature miRNAs of the let-7 family are poorly expressed in undifferentiated embryonic stem cells (ESCs) but their primary let-7 precursor transcripts are readily detected (Thomson et al., 2006Thomson J.M. Newman M. Parker J.S. Morin-Kensicki E.M. Wright T. Hammond S.M. Genes Dev. 2006; 20: 2202-2207Crossref PubMed Scopus (716) Google Scholar).This suggests that mature let-7 miRNAs are maintained at low levels posttranscriptionally in ESCs and their target genes are not repressed. Recent evidence suggests that let-7 opposes the actions of a family of ESC cell-cycle-regulating miRNAs that maintain self-renewal (Melton et al., 2010Melton C. Judson R.L. Blelloch R. Nature. 2010; 463: 621-626Crossref PubMed Scopus (531) Google Scholar). In the reprogramming cocktail used by Yu et al., 2007Yu F. Yao H. Zhu P. Zhang X. Pan Q. Gong C. Huang Y. Hu X. Su F. Lieberman J. Song E. Cell. 2007; 131: 1109-1123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1578) Google Scholar, LIN28 functionally replaces c-MYC, and c-MYC is a known target of let-7 (Kumar et al., 2007Kumar M.S. Lu J. Mercer K.L. Golub T.R. Jacks T. Nat. Genet. 2007; 39: 673-677Crossref PubMed Scopus (1195) Google Scholar), which supports the notion that LIN28 promotes reprogramming by preventing production of mature let-7 miRNAs. Several reports also indicate that Lin28 can affect protein levels by regulating mRNA stability (Polesskaya et al., 2007Polesskaya A. Cuvellier S. Naguibneva I. Duquet A. Moss E.G. Harel-Bellan A. Genes Dev. 2007; 21: 1125-1138Crossref PubMed Scopus (225) Google Scholar, Xu et al., 2009Xu B. Zhang K. Huang Y. RNA. 2009; 15: 357-361Crossref PubMed Scopus (151) Google Scholar, Qiu et al., 2009Qiu C. Ma Y. Wang J. Peng S. Huang Y. Nucleic Acids Res. 2009; (Published online December 4, 2009)https://doi.org/10.1093/nar/gkp1071Crossref Scopus (166) Google Scholar), and that Lin28 directly promotes the translation of OCT4 mRNA (Qiu et al., 2009Qiu C. Ma Y. Wang J. Peng S. Huang Y. Nucleic Acids Res. 2009; (Published online December 4, 2009)https://doi.org/10.1093/nar/gkp1071Crossref Scopus (166) Google Scholar) and may modulate cell proliferation by enhancing the translation of various cell-cycle regulators in mouse ESCs (Xu et al., 2009Xu B. Zhang K. Huang Y. RNA. 2009; 15: 357-361Crossref PubMed Scopus (151) Google Scholar). Therefore, Lin28 may promote reprogramming through both miRNA-dependent and miRNA-independent pathways. In some cases, it is also possible that regulation of mRNA stability may be a secondary consequence of Lin28-mediated modulation of miRNA processing. In addition to c-MYC, several other oncogenes are known to be targets of let-7, including K-Ras and cyclin D1 (reviewed in Roush and Slack, 2008Roush S. Slack F.J. Trends Cell Biol. 2008; 18: 505-516Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (909) Google Scholar). Therefore, let-7 may act as a tumor suppressor miRNA, and its loss has been linked to oncogenesis (Johnson et al., 2005Johnson S.M. Grosshans H. Shingara J. Byrom M. Jarvis R. Cheng A. Labourier E. Reinert K.L. Brown D. Slack F.J. Cell. 2005; 120: 635-647Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2984) Google Scholar, Takamizawa et al., 2004Takamizawa J. Konishi H. Yanagisawa K. Tomida S. Osada H. Endoh H. Harano T. Yatabe Y. Nagino M. Nimura Y. et al.Cancer Res. 2004; 64: 3753-3756Crossref PubMed Scopus (2071) Google Scholar). Mammalian genomes contain multiple let-7 family members processed from distinct precursor transcripts. In settings where let-7 family members are coexpressed and show functional redundancy, genetic events that inactivate individual let-7 members may not have dramatic phenotypic consequences. However, given that LIN28/LIN28B regulates all let-7 family miRNAs, could LIN28/LIN28B contribute to oncogenesis by coordinately inactivating let-7 family miRNAs? We have found that LIN28/LIN28B can promote transformation by repressing let-7 miRNAs, and that activation of LIN28/LIN28B occurs in many different human tumors with a frequency of ∼15% (Viswanathan et al., 2009Viswanathan S.R. Powers J.T. Einhorn W. Hoshida Y. Ng T.L. Toffanin S. O'Sullivan M. Lu J. Phillips L.A. Lockhart V.L. et al.Nat. Genet. 2009; 41: 843-848Crossref PubMed Scopus (616) Google Scholar). It is indeed intriguing, but perhaps no coincidence, that all currently described reprogramming factors—OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, and LIN28—have been linked to oncogenesis. This underscores the notion that the complex genomic reprogramming that accompanies induced pluripotency shares many commonalities with the complex, albeit aberrant, genomic reprogramming that accompanies neoplastic transformation. Strikingly, LIN28 and LIN28B are specifically activated in the subset of tumors that are poorly differentiated and carry the worst prognosis (Viswanathan et al., 2009Viswanathan S.R. Powers J.T. Einhorn W. Hoshida Y. Ng T.L. Toffanin S. O'Sullivan M. Lu J. Phillips L.A. Lockhart V.L. et al.Nat. Genet. 2009; 41: 843-848Crossref PubMed Scopus (616) Google Scholar). Aggressive, high-grade tumors are frequently characterized by impaired differentiation, and pathologists often use the differentiation status of a tumor as a metric for scoring cancer severity. When expressed in the proper genetic and epigenetic context, LIN28 together with OCT4, SOX2, and NANOG can promote the reprogramming of a terminally differentiated cell to a pluripotent ESC-like cell. But when aberrantly expressed, LIN28/LIN28B may contribute to the development of an aggressive, poorly differentiated tumor. Indeed, a recent report suggests that several different types of aggressive poorly differentiated tumors, including basal-like breast cancers and high-grade bladder carcinomas, express an ESC-like gene signature (Ben Porath et al., 2008Ben Porath I. Thomson M.W. Carey V.J. Ge R. Bell G.W. Regev A. Weinberg R.A. Nat. Genet. 2008; 40: 499-507Crossref PubMed Scopus (1800) Google Scholar). Poorly differentiated tumors might arise either from stem or progenitor cells that acquire additional malignant hits or from somatic cells that dedifferentiate by activating components of the pluripotency machinery (Figure 1). In the case of LIN28B, rare amplification or translocation events might explain activation in some cases (Viswanathan et al., 2009Viswanathan S.R. Powers J.T. Einhorn W. Hoshida Y. Ng T.L. Toffanin S. O'Sullivan M. Lu J. Phillips L.A. Lockhart V.L. et al.Nat. Genet. 2009; 41: 843-848Crossref PubMed Scopus (616) Google Scholar). A more common mechanism, however, might be transcriptional activation by an upstream factor or factors during tumor progression. In support of this notion, c-Myc binds to both the Lin28 (Dangi-Garimella et al., 2009Dangi-Garimella S. Yun J. Eves E.M. Newman M. Erkeland S.J. Hammond S.M. Minn A.J. Rosner M.R. EMBO J. 2009; 28: 347-358Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar) and LIN28B (Chang et al., 2009Chang T.C. Zeitels L.R. Hwang H.W. Chivukula R.R. Wentzel E.A. Dews M. Jung J. Gao P. Dang C.V. Beer M.A. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 3384-3389Crossref PubMed Scopus (309) Google Scholar) loci and activates expression of these genes. However, c-Myc activation in tumors is far more common than LIN28/LIN28B activation—the need for transcriptional coactivators or epigenetic inaccessibility of the LIN28/LIN28B loci may explain this. Finally, in some cases, LIN28/LIN28B may be expressed in a rare somatic progenitor cell of origin that becomes transformed (Figure 1). Regardless of the mechanism of activation, which may vary from tumor to tumor, cancers expressing LIN28/LIN28B appear to be dependent on these proteins for growth (Chang et al., 2009Chang T.C. Zeitels L.R. Hwang H.W. Chivukula R.R. Wentzel E.A. Dews M. Jung J. Gao P. Dang C.V. Beer M.A. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 3384-3389Crossref PubMed Scopus (309) Google Scholar, Dangi-Garimella et al., 2009Dangi-Garimella S. Yun J. Eves E.M. Newman M. Erkeland S.J. Hammond S.M. Minn A.J. Rosner M.R. EMBO J. 2009; 28: 347-358Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar, Viswanathan et al., 2009Viswanathan S.R. Powers J.T. Einhorn W. Hoshida Y. Ng T.L. Toffanin S. O'Sullivan M. Lu J. Phillips L.A. Lockhart V.L. et al.Nat. Genet. 2009; 41: 843-848Crossref PubMed Scopus (616) Google Scholar). The precise manner by which LIN28 contributes to tumorigenesis presents a compelling avenue for future investigation, and there are several intriguing possibilities. Rare breast tumor-initiating cells express low levels of all let-7 family miRNAs (Yu et al., 2007Yu F. Yao H. Zhu P. Zhang X. Pan Q. Gong C. Huang Y. Hu X. Su F. Lieberman J. Song E. Cell. 2007; 131: 1109-1123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1578) Google Scholar). Meanwhile reduced let-7 levels have been shown to confer radioresistance, whereas increased let-7 levels confer radiosensitivity (Weidhaas et al., 2007Weidhaas J.B. Babar I. Nallur S.M. Trang P. Roush S. Boehm M. Gillespie E. Slack F.J. Cancer Res. 2007; 67: 11111-11116Crossref PubMed Scopus (337) Google Scholar). Knocking down LIN28B expression in a radioresistant lung cancer cell line increased let-7 levels and decreased expression of K-RAS, a let-7 target, resulting in enhanced radiosensitivity (Jeong et al., 2009Jeong S.H. Wu H.G. Park W.Y. Exp. Mol. Med. 2009; 41: 912-918Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar). Therefore, tumor-initiating cells expressing LIN28/LIN28B may persist after chemotherapy and may seed relapse in some patients. Emerging evidence suggests that HMGA2, another target of let-7, actively promotes the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), a key event in development and metastasis (Dangi-Garimella et al., 2009Dangi-Garimella S. Yun J. Eves E.M. Newman M. Erkeland S.J. Hammond S.M. Minn A.J. Rosner M.R. EMBO J. 2009; 28: 347-358Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar, Shell et al., 2007Shell S. Park S.M. Radjabi A.R. Schickel R. Kistner E.O. Jewell D.A. Feig C. Lengyel E. Peter M.E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104: 11400-11405Crossref PubMed Scopus (388) Google Scholar). The observation that LIN28 and LIN28B are specifically activated in advanced stage and high-grade tumors suggests that they play a role later during tumorigenesis. Furthermore, Lin28 and let-7 have been placed directly within a metastasis signaling cascade (Dangi-Garimella et al., 2009Dangi-Garimella S. Yun J. Eves E.M. Newman M. Erkeland S.J. Hammond S.M. Minn A.J. Rosner M.R. EMBO J. 2009; 28: 347-358Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar). Notably, Lin28 shares many parallels with Twist, a factor recently identified as an inducer of EMT and a key mediator of metastasis (Dangi-Garimella et al., 2009Dangi-Garimella S. Yun J. Eves E.M. Newman M. Erkeland S.J. Hammond S.M. Minn A.J. Rosner M.R. EMBO J. 2009; 28: 347-358Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar, Mani et al., 2008Mani S.A. Guo W. Liao M.J. Eaton E.N. Ayyanan A. Zhou A.Y. Brooks M. Reinhard F. Zhang C.C. Shipitsin M. et al.Cell. 2008; 133: 704-715Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6231) Google Scholar). Both Lin28 and Twist are encoded by developmentally regulated genes, are associated with advanced malignancy and regulatory circuits involving c-Myc, and both strongly cooperate with other oncogenes in assays of cell transformation (Mani et al., 2008Mani S.A. Guo W. Liao M.J. Eaton E.N. Ayyanan A. Zhou A.Y. Brooks M. Reinhard F. Zhang C.C. Shipitsin M. et al.Cell. 2008; 133: 704-715Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6231) Google Scholar, Valsesia-Wittmann et al., 2004Valsesia-Wittmann S. Magdeleine M. Dupasquier S. Garin E. Jallas A.C. Combaret V. Krause A. Leissner P. Puisieux A. Cancer Cell. 2004; 6: 625-630Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (202) Google Scholar). Elucidating whether LIN28 and LIN28B have a direct role in promoting metastasis is a potentially rewarding avenue for future work. Several studies place Lin28/Lin28b within an important regulatory network involving c-Myc and let-7 (Chang et al., 2009Chang T.C. Zeitels L.R. Hwang H.W. Chivukula R.R. Wentzel E.A. Dews M. Jung J. Gao P. Dang C.V. Beer M.A. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 3384-3389Crossref PubMed Scopus (309) Google Scholar, Dangi-Garimella et al., 2009Dangi-Garimella S. Yun J. Eves E.M. Newman M. Erkeland S.J. Hammond S.M. Minn A.J. Rosner M.R. EMBO J. 2009; 28: 347-358Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar). Lin28/Lin28b represses let-7, which is itself able to repress Lin28/Lin28b by binding to the 3′UTR of Lin28/Lin28b transcripts, thus forming a double-negative-feedback loop. A second feedback loop exists between Lin28 and c-Myc: Lin28/Lin28b derepresses c-Myc by repressing let-7, and c-Myc transcriptionally activates both Lin28 and Lin28b (Chang et al., 2009Chang T.C. Zeitels L.R. Hwang H.W. Chivukula R.R. Wentzel E.A. Dews M. Jung J. Gao P. Dang C.V. Beer M.A. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 3384-3389Crossref PubMed Scopus (309) Google Scholar, Dangi-Garimella et al., 2009Dangi-Garimella S. Yun J. Eves E.M. Newman M. Erkeland S.J. Hammond S.M. Minn A.J. Rosner M.R. EMBO J. 2009; 28: 347-358Crossref PubMed Scopus (297) Google Scholar). Notably, derepression of c-Myc might also contribute to the transcriptional repression of diverse miRNAs and transcriptional activation of certain oncogenic miRNAs (Chang et al., 2008Chang T.C. Yu D. Lee Y.S. Wentzel E.A. Arking D.E. West K.M. Dang C.V. Thomas-Tikhonenko A. Mendell J.T. Nat. Genet. 2008; 40: 43-50Crossref PubMed Scopus (1051) Google Scholar). This Lin28/let-7/c-Myc loop may partially explain the widespread deregulation of miRNAs observed in many human malignancies (Lu et al., 2005Lu J. Getz G. Miska E.A. Alvarez-Saavedra E. Lamb J. Peck D. Sweet-Cordero A. Ebert B.L. Mak R.H. Ferrando A.A. et al.Nature. 2005; 435: 834-838Crossref PubMed Scopus (7741) Google Scholar). There is also a positive-feedback loop involving NF-κB, Lin28b, let-7, and IL-6: NF-κB induces expression of Lin28b, leading to repression of let-7 and expression of the gene encoding IL-6 (a let-7 target). IL-6 can itself activate NF-κB, completing a positive-feedback loop. In an experimental system, transient induction of the Src tyrosine kinase activates NF-κB and initiates this positive-feedback loop, resulting in neoplastic transformation. This loop operates in cancer cell lines and breast tumor-initiating cells and has been suggested to link the inflammatory response, of which IL-6 is a component, to cancer (Iliopoulos et al., 2009Iliopoulos D. Hirsch H.A. Struhl K. Cell. 2009; 139: 693-706Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1067) Google Scholar). Both of these loops may function in normal development: double negative-feedback loops have been postulated to play a central role in gene regulatory networks by forming "bistable switches" that reinforce binary cell fate decisions (Martinez et al., 2008Martinez N.J. Ow M.C. Barrasa M.I. Hammell M. Sequerra R. Doucette-Stamm L. Roth F.P. Ambros V.R. Walhout A.J.M. Genes Dev. 2008; 22: 2535-2549Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). Several genome-wide association studies (GWAS) have implicated LIN28B as a regulator of human development. Hirschhorn and colleagues identified markers near 12 loci that account for 2% of the population variation in human height; 1 of the 12 loci identified was LIN28B, and several other loci encode let-7 targets (Lettre et al., 2008Lettre G. Jackson A.U. Gieger C. Schumacher F.R. Berndt S.I. Sanna S. Eyheramendy S. Voight B.F. Butler J.L. Guiducci C. et al.Nat. Genet. 2008; 40: 584-591Crossref PubMed Scopus (436) Google Scholar). More recently, several independent GWAS have identified common polymorphisms near LIN28B as being associated with a woman's age at menarche (reviewed in Hartge, 2009Hartge P. Nat. Genet. 2009; 41: 637-638Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Together with established data in the worm, the identification of relevant human genetic variations suggests that the Lin28/let-7 axis may be an important regulator of cell growth and development in evolutionarily distant organisms. Subtle variations in the activity of this pathway may result in height or size differences among individuals of the same species, and more dramatic perturbations of this pathway may drive oncogenesis. Thus, Lin28/Lin28b may be similar to PI3-kinase, mTOR, and components of the Hippo pathway, which contribute to the regulation of organ growth and size and may be deregulated in some cancers. Several recent reports suggest that Lin28 may cooperate with a terminal uridylyl transferase (TUTase) to regulate blockade of let-7 production (Figure 2). Lin28 and Lin28b are associated with a TUTase activity that results in the addition of a poly-U tail to the let-7 precursor, pre-let-7 (Heo et al., 2008Heo I. Joo C. Cho J. Ha M. Han J. Kim V.N. Mol. Cell. 2008; 32: 276-284Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (736) Google Scholar). Uridylated pre-let-7 cannot be efficiently processed by the enzyme Dicer and is targeted for degradation. Three groups have now identified the enzyme responsible for this activity in both mammalian cells (TUT4/zcchc11) (Heo et al., 2009Heo I. Joo C. Kim Y.K. Ha M. Yoon M.J. Cho J. Yeom K.H. Han J. Kim V.N. Cell. 2009; 138: 696-708Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (599) Google Scholar, Hagan et al., 2009Hagan J.P. Piskounova E. Gregory R.I. Nat. Struct. Mol. Biol. 2009; 16: 1021-1025Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar) and in C. elegans (PUP-2) (Lehrbach et al., 2009Lehrbach N.J. Armisen J. Lightfoot H.L. Murfitt K.J. Bugaut A. Balasubramanian S. Miska E.A. Nat. Struct. Mol. Biol. 2009; 16: 1016-1020Crossref PubMed Scopus (190) Google Scholar). Together, these reports outline an evolutionarily ancient pathway in which Lin28 recognizes pre-let-7 via a motif in its terminal loop and recruits a TUTase to mark pre-let-7 for degradation. Lin28/TUT4-mediated uridylation of other pre-miRNAs with similar loop motifs has also been reported (Heo et al., 2009Heo I. Joo C. Kim Y.K. Ha M. Yoon M.J. Cho J. Yeom K.H. Han J. Kim V.N. Cell. 2009; 138: 696-708Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (599) Google Scholar). Given that polymerases are facile targets for pharmacological inhibition by small molecules, TUT4 may prove to be an attractive pharmaceutical target for manipulating the LIN28/let-7 axis in cancer cells. The terminal loops of miRNA precursors serve essential regulatory roles (Trabucchi et al., 2009Trabucchi M. Briata P. Garcia-Mayoral M. Haase A.D. Filipowicz W. Ramos A. Gherzi R. Rosenfeld M.G. Nature. 2009; 459: 1010-1014Crossref PubMed Scopus (491) Google Scholar, Michlewski et al., 2008Michlewski G. Guil S. Semple C.A. Cßceres J.F. Mol. Cell. 2008; 32: 383-393Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (264) Google Scholar, Guil and Caceres, 2007Guil S. Caceres J.F. Nat. Struct. Mol. Biol. 2007; 14: 591-596Crossref PubMed Scopus (415) Google Scholar, Piskounova et al., 2008Piskounova E. Viswanathan S.R. Janas M. LaPierre R.J. Daley G.Q. Sliz P. Gregory R.I. J. Biol. Chem. 2008; 283: 21310-21314Crossref PubMed Scopus (274) Google Scholar); for example, hnRNPA1 binds to the terminal loop of pri-miR-18a and enhances Drosha-mediated processing of this precursor into the mature miRNA (Guil and Caceres, 2007Guil S. Caceres J.F. Nat. Struct. Mol. Biol. 2007; 14: 591-596Crossref PubMed Scopus (415) Google Scholar). The RNA-binding protein KSRP binds to the terminal loop of a subset of miRNAs, including let-7, and enhances their processing (Trabucchi et al., 2009Trabucchi M. Briata P. Garcia-Mayoral M. Haase A.D. Filipowicz W. Ramos A. Gherzi R. Rosenfeld M.G. Nature. 2009; 459: 1010-1014Crossref PubMed Scopus (491) Google Scholar). Indeed, it is quite likely that the expression of many miRNAs is controlled at the level of processing, with the terminal loop serving as a point of regulation (Michlewski et al., 2008Michlewski G. Guil S. Semple C.A. Cßceres J.F. Mol. Cell. 2008; 32: 383-393Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (264) Google Scholar). The factors that control miRNA biogenesis are likely to confer an additional layer of precision, complexity, and versatility to gene regulation. The therapeutic targeting of such regulatory factors may be a viable strategy to reduce or enhance the expression of specific miRNAs in the setting of human disease. Recent studies of Lin28 and let-7 have highlighted the fact that normal development, somatic cell reprogramming, and oncogenesis share common pathways. Going forward, it will be critical to define precise roles for Lin28/Lin28b in each of these settings. This will allow us to understand how the Lin28/let-7 pathway functions in physiological development, how it is deregulated during tumorigenesis, and how it can be experimentally exploited to enhance the production of pluripotent cells. More broadly, further investigation of the Lin28/let-7 partnership may lend insight into the mechanisms and consequences of the regulation of miRNA expression by trans-acting factors. GQD is a member of the Scientific Advisory Board of MPM Capital, iPierian, and Epizyme.

An RNA interference screen of 30 gene candidates has identified Lin28, a negative regulator of let-7 microRNA processing, as a potentially key regulator of primordial germ cell development, the process in the developing embryo that selects the cells destined to produce sperm and eggs. In addition, Lin28 levels are elevated in primary human germ cell tumours, suggesting that it may also be implicated in germ cell malignancy. In order to investigate the earliest molecular mechanisms of germ cell specification, mouse embryonic stem cells were differentiated into putative primordial germ cells (PGCs) in vitro. The use of inhibitory RNAs to then screen candidate genes for effects on the development of these cells demonstrates a genetic pathway for PGC specification involving Lin28, a negative regulator of let-7 microRNA processing. The rarity and inaccessibility of the earliest primordial germ cells (PGCs) in the mouse embryo thwart efforts to investigate molecular mechanisms of germ-cell specification. stella (also called Dppa3) marks the rare founder population of the germ lineage1,2. Here we differentiate mouse embryonic stem cells carrying a stella transgenic reporter into putative PGCs in vitro. The Stella+ cells possess a transcriptional profile similar to embryo-derived PGCs, and like their counterparts in vivo, lose imprints in a time-dependent manner. Using inhibitory RNAs to screen candidate genes for effects on the development of Stella+ cells in vitro, we discovered that Lin28, a negative regulator of let-7 microRNA processing3,4,5,6, is essential for proper PGC development. Furthermore, we show that Blimp1 (also called Prdm1), a let-7 target and a master regulator of PGC specification7,8,9, can rescue the effect of Lin28 deficiency during PGC development, thereby establishing a mechanism of action for Lin28 during PGC specification. Overexpression of Lin28 promotes formation of Stella+ cells in vitro and PGCs in chimaeric embryos, and is associated with human germ-cell tumours. The differentiation of putative PGCs from embryonic stem cells in vitro recapitulates the early stages of gamete development in vivo, and provides an accessible system for discovering novel genes involved in germ-cell development and malignancy.

The developmentally regulated RNA-binding protein Lin28 blocks processing of let-7 family microRNAs (miRNAs) in embryonic cells. The molecular basis for this selective miRNA processing block is unknown. Here we find that Lin28 selectively binds the terminal loop region of let-7 precursors in vitro and that the loop mediates miRNA processing inhibition in vivo. Additionally, we identify the domains of Lin28 required for this inhibition. These findings establish a regulatory role for the terminal loop of precursors in miRNA maturation and provide insight into the mechanism by which Lin28 negatively regulates let-7 processing. The developmentally regulated RNA-binding protein Lin28 blocks processing of let-7 family microRNAs (miRNAs) in embryonic cells. The molecular basis for this selective miRNA processing block is unknown. Here we find that Lin28 selectively binds the terminal loop region of let-7 precursors in vitro and that the loop mediates miRNA processing inhibition in vivo. Additionally, we identify the domains of Lin28 required for this inhibition. These findings establish a regulatory role for the terminal loop of precursors in miRNA maturation and provide insight into the mechanism by which Lin28 negatively regulates let-7 processing. MicroRNAs (miRNAs) 2The abbreviations used are: miRNA, microRNA; pri-miRNA, primary microRNA; pre-miRNA, precursor microRNA; EMSA, electrophoretic mobility shift assay; CSD, cold shock domain; nt, nucleotide; pre-let-7g, precursor let-7g; pri-let-7g, primary let-7g; rLin28, recombinant Lin28; WT, wild-type. comprise a large family of short regulatory RNAs that repress the expression of target messenger RNAs and have many important roles in development (1Zhao Y. Srivastava D. Trends Biochem. Sci. 2007; 32: 189-197Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (485) Google Scholar). In addition to the requirement of miRNAs for normal development, it is emerging that altered miRNA expression is a hallmark of various cancers (2Calin G.A. Croce C.M. Nat. Rev. 2006; 6: 857-866Crossref Scopus (6664) Google Scholar). Several examples of miRNAs with oncogenic or tumor suppressor properties have been reported. Notably, let-7 miRNA has been reported to play a tumor suppressor role by repression of oncogenes including Hmga2, Ras, and Myc (3Mayr C. Hemann M.T. Bartel D.P. Science. 2007; 315: 1576-1579Crossref PubMed Scopus (992) Google Scholar, 4Lee Y.S. Dutta A. Genes Dev. 2007; 21: 1025-1030Crossref PubMed Scopus (1033) Google Scholar, 5Johnson S.M. Grosshans H. Shingara J. Byrom M. Jarvis R. Cheng A. Labourier E. Reinert K.L. Brown D. Slack F.J. Cell. 2005; 120: 635-647Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3119) Google Scholar, 6Sampson V.B. Rong N.H. Han J. Yang Q. Aris V. Soteropoulos P. Petrelli N.J. Dunn S.P. Krueger L.J. Cancer Res. 2007; 67: 9762-9770Crossref PubMed Scopus (676) Google Scholar). Reduced expression of let-7 miRNA in human lung cancers is associated with shortened postoperative survival (7Takamizawa J. Konishi H. Yanagisawa K. Tomida S. Osada H. Endoh H. Harano T. Yatabe Y. Nagino M. Nimura Y. Mitsudomi T. Takahashi T. Cancer Res. 2004; 64: 3753-3756Crossref PubMed Scopus (2164) Google Scholar), and in a mouse lung cancer model, let-7g inhibits tumor development (8Kumar M.S. Erkeland S.J. Pester R.E. Chen C.Y. Ebert M.S. Sharp P.A. Jacks T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008; 105: 3903-3908Crossref PubMed Scopus (766) Google Scholar). Additionally, low let-7 expression is important for the self-renewal and tumorigenicity of breast cancer initiating cells (9Yu F. Yao H. Zhu P. Zhang X. Pan Q. Gong C. Huang Y. Hu X. Su F. Lieberman J. Song E. Cell. 2007; 131: 1109-1123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1657) Google Scholar). Hundreds of miRNAs have now been identified, many of which are expressed in a tissue- and developmental stage-specific manner. Under most conditions, control of their expression occurs at the transcriptional level. The miRNA biogenesis pathway involves the sequential processing of primary miRNA transcripts (pri-miRNAs) by the Microprocessor complex (comprising the RNaseIII enzyme Drosha and the double-stranded RNA-binding protein DGCR8) to release 60–70-nt precursor miRNAs (pre-miRNAs) that are subsequently cleaved by the Dicer complex to yield mature ∼22 nt miRNAs (10Gregory R.I. Yan K.P. Amuthan G. Chendrimada T. Doratotaj B. Cooch N. Shiekhattar R. Nature. 2004; 432: 235-240Crossref PubMed Scopus (2129) Google Scholar, 11Denli A.M. Tops B.B. Plasterk R.H. Ketting R.F. Hannon G.J. Nature. 2004; 432: 231-235Crossref PubMed Scopus (2038) Google Scholar, 12Gregory R.I. Chendrimada T.P. Cooch N. Shiekhattar R. Cell. 2005; 123: 631-640Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1232) Google Scholar, 13Kim V.N. Nam J.W. Trends Genet. 2006; 22: 165-173Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (780) Google Scholar). Emerging evidence indicates that miRNA biogenesis can also be regulated posttranscriptionally (14Thomson J.M. Newman M. Parker J.S. Morin-Kensicki E.M. Wright T. Hammond S.M. Genes Dev. 2006; 20: 2202-2207Crossref PubMed Scopus (761) Google Scholar, 15Obernosterer G. Leuschner P.J. Alenius M. Martinez J. RNA (N. Y.). 2006; 12: 1161-1167Crossref PubMed Scopus (383) Google Scholar, 16Yang W. Chendrimada T.P. Wang Q. Higuchi M. Seeburg P.H. Shiekhattar R. Nishikura K. Nat. Struct. Mol. Biol. 2006; 13: 13-21Crossref PubMed Scopus (608) Google Scholar, 17Kawahara Y. Zinshteyn B. Chendrimada T.P. Shiekhattar R. Nishikura K. EMBO Rep. 2007; 8: 763-769Crossref PubMed Scopus (321) Google Scholar, 18Viswanathan S.R. Daley G.Q. Gregory R.I. Science. 2008; 320: 97-100Crossref PubMed Scopus (1197) Google Scholar). The developmentally regulated RNA-binding protein Lin28 was recently identified as a selective inhibitor of miRNA processing in embryonic stem cells and embryonal carcinoma cells (18Viswanathan S.R. Daley G.Q. Gregory R.I. Science. 2008; 320: 97-100Crossref PubMed Scopus (1197) Google Scholar). Lin28 inhibits the maturation of the let-7 family but not other miRNAs, yet a mechanistic explanation for this selectivity is unknown. We sought to gain insight into the mechanism by which Lin28 selectively blocks the processing of let-7 family miRNAs. Using in vitro and in vivo assays, we explored the RNA sequence and structural requirements for Lin28-mediated regulation and found that Lin28 specifically binds the terminal loop region of let-7 precursors. Furthermore, we demonstrated that the loop mediates miRNA processing inhibition in vivo and identified the domains of Lin28 required for this inhibition. Electromobilty Shift Assays (EMSA)—EMSA was conducted using ∼2 × 105 cpm 5′-end-labeled pre-miRNA probe, together with the indicated amounts of competitor RNA and recombinant Lin28 that was prepared as described previously (18Viswanathan S.R. Daley G.Q. Gregory R.I. Science. 2008; 320: 97-100Crossref PubMed Scopus (1197) Google Scholar). Binding reactions were conducted in 20 μl of total volume with 30 μg of yeast tRNA. Binding buffer contained 100 mm NaCl, 50 mm Tris (pH 7.6), 5% glycerol, 20 units of RnaseOUT, and 10 mm β-mercaptoethanol. Bound complexes were resolved on native 5% polyacrylamide gels. Band intensities of scanned gels were quantified using Adobe PhotoShop software. The data were fitted to a hyperbolic function of the nonlinear curve fitting method of GraphPad Prism. The total amount of probe in each binding reaction was normalized against the unbound probe (in the absence of recombinant Lin28 protein (rLin28)) and used to calculate the fraction bound by rLin28. Dissociation constants of pre-let-7g and the let-7g terminal loop were derived from a fit to the equation: Fraction bound = Bmax([rLin28])/(Kd + [rLin28]), where Bmax represents the observed maximum fraction of probe bound, [rLin28] represents protein concentration, and Kd is the dissociation constant. Cell Culture, Transfection, and Immunoprecipitations—Transient transfections of 293T and HEK293 cells were performed using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) per the manufacturer's instructions. Cell lysates were prepared using a buffer containing 20 mm Tris-HCl (pH 8.0), 137 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1.5 mm MgCl2, 0.2 mm Phenylmethylsulfonyl fluoride, and 0.5 mm dithiothreitol. FLAG-Lin28 immunoprecipitations were preformed using anti-FLAG-agarose beads (Sigma). After a 90-min incubation, the beads were washed twice with BC500 buffer: 20 mm Tris-HCl (pH 7.8), 500 mm KCl, 0.2 mm EDTA, 10% glycerol, 10 mm β-mercaptoethanol (pH 7.8), 0.2% Nonidet P-40, 0.2 mm phenylmethylsulfonyl fluoride followed by one wash with BC100 (as above except with 100 mm KCl) before elution with FLAG-peptide (Sigma). Quantitative PCR and Mutagenesis—Levels of mature miRNA species were measured by quantitative PCR using commercially available TaqMan probes (Applied Biosystems) per the manufacturer's instructions with sno142 RNA or U47 RNA used as internal standards for normalization. The plasmid for expression of let-7g loop/miR-21 was generated using the QuikChange kit (Stratagene) and the following primers to amplify from the pcDNA3-pri-let-7g plasmid: forward, 5′-CTGAGGTAGTAGTTTGTACAGTTCTGTTGAATCTCATGGACTGTACAGGCCACTGCCTTG-3′, and reverse, 5′-CAAGGCAGTGGCCTGTACAGTCCATGAGATTCAACAGAACTGTACAAACTACTACCTCAG-3′. Plasmids for the expression of the Lin28 proteins containing single amino acid substitutions were generated by site-directed mutagenesis of the pCMV2-Lin28 using the QuikChange kit (Stratagene). Northern Blotting—20 μg of total RNA from each sample was used for Northern blotting as described previously (10Gregory R.I. Yan K.P. Amuthan G. Chendrimada T. Doratotaj B. Cooch N. Shiekhattar R. Nature. 2004; 432: 235-240Crossref PubMed Scopus (2129) Google Scholar). Probes for miRNA detection were antisense, end-labeled DNA oligonucleotides to the mature miRNA sequence. Lin28 Selectively Binds the Terminal Loop Region of Precursor let-7 miRNAs—We sought to gain insight into the molecular determinants of Lin28-mediated miRNA processing inhibition. Using EMSA, we demonstrated that recombinant Lin28 selectively binds pre-let-7g RNA (Fig. 1A) but not other pre-miRNAs tested (data not shown). From these experiments, we determined the estimated Kd of Lin28 binding to pre-let-7g to be 2.1 ± 0.32 μm (Fig. 1A). Furthermore, competition experiments with unlabeled (cold) pre-let-7g or cold control pre-miRNA (pre-miR-138) demonstrated that Lin28 binds let-7g with at least 200-fold greater affinity than control miRNAs (Fig. 1B). The hairpin-shaped pre-miRNAs contain a highly base-paired stem that contains the mature miRNA sequence and the complementary miRNA* sequence that are connected by a terminal loop region that, depending on the particular pre-miRNA, may also contain base-paired regions. For clarity, we refer to this as the “loop” hereafter (Fig. 1C). We did not detect Lin28 binding to 22 nt let-7g (miRNA:miRNA*) duplex in EMSA (data not shown). However, using the same EMSA conditions, we detected robust binding to the let-7g terminal loop sequence with an estimated Kd value of 1.5 ± 0.28 μm (Fig. 1D). The Terminal Loop Sequence of Precursor miRNAs Mediates Lin28 Binding in Vitro and Processing Inhibition in Vivo—In mice and humans, the let-7 family miRNAs comprises 12 members, the mature miRNA sequence of which is highly conserved between the different genes (Fig. 2A). Since Lin28 inhibits processing of all let-7 family members and specifically binds the terminal loop of let-7g (Fig. 1D), we hypothesized that there should be common RNA sequence or structural features that confer Lin28-mediated regulation. Indeed, we identified a conserved cytosine nucleotide in the terminal loop region of pre-let-7 miRNAs (Fig. 2A). Although changing this cytosine to an adenosine is not predicted to alter the folding of the pre-let-7g loop region (Fig. 2B), we found that this single nucleotide substitution dramatically reduced Lin28 binding more than 20-fold relative to the wild-type pre-let-7g loop (Fig. 2B). Next, we investigated the role of the loop region in the Lin28-mediated inhibition of miRNA maturation in vivo. HEK293 cells were transfected with plasmids for the expression of let-7g or a chimeric pri-miRNA in which the terminal loop sequence was replaced with that of miR-21 (a miRNA that is not regulated by Lin28) (18Viswanathan S.R. Daley G.Q. Gregory R.I. Science. 2008; 320: 97-100Crossref PubMed Scopus (1197) Google Scholar). Although expression of Lin28 blocked the maturation of let-7g by ∼90%, the expression of let-7g stem/miR-21 loop construct was unaffected by Lin28 (Fig. 2C). Both the Cold Shock Domains (CSDs) and the Zinc Finger Domains of Lin28 Are Required for pre-let-7 Binding in Vitro and Processing Inhibition in Vivo—Next, we sought to identify the Lin28 protein determinants of the miRNA processing block. Lin28 contains a CSD and two retroviral-type zinc fingers (Fig. 3A). Notably, Lin28 and Lin28B can both block let-7 processing and are the only proteins with this combination of motifs (18Viswanathan S.R. Daley G.Q. Gregory R.I. Science. 2008; 320: 97-100Crossref PubMed Scopus (1197) Google Scholar, 19Moss E.G. Lee R.C. Ambros V. Cell. 1997; 88: 637-646Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (688) Google Scholar, 20Balzer E. Moss E.G. RNA Biol. 2007; 4: 16-25Crossref PubMed Scopus (153) Google Scholar). CSDs contain ∼70 amino acids that are conserved in prokaryotic and eukaryotic DNA-binding proteins, part of which is highly similar to the RNP-1 RNA-binding motif (21Graumann P.L. Marahiel M.A. Trends Biochem. Sci. 1998; 23: 286-290Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (374) Google Scholar, 22Landsman D. Nucleic Acids Res. 1992; 20: 2861-2864Crossref PubMed Scopus (107) Google Scholar, 23Schindelin H. Jiang W. Inouye M. Heinemann U. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 5119-5123Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar, 24Frazao C. McVey C.E. Amblar M. Barbas A. Vonrhein C. Arraiano C.M. Carrondo M.A. Nature. 2006; 443: 110-114Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar). The Cys-Cys-His-Cys (CCHC) type zinc finger domains are found predominantly in nucleocapsid proteins of retroviruses, which are required for viral genome packaging and for the early infection process (25De Guzman R.N. Wu Z.R. Stalling C.C. Pappalardo L. Borer P.N. Summers M.F. Science. 1998; 279: 384-388Crossref PubMed Scopus (610) Google Scholar, 26Hall T.M. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005; 15: 367-373Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar, 27Brown R.S. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005; 15: 94-98Crossref PubMed Scopus (225) Google Scholar). Therefore, both the CSD and the CCHC domains may be important for RNA binding by Lin28. To test this, we generated single amino acid substitutions in either the CSD or the CCHC domains and tested their relative ability to bind to pre-let-7g (Fig. 3B). We identified single amino acid residues required for binding to pre-let-7g (F47A, F73A, C161A), whereas other residues had no effect (K45A). Next, we tested the effect of these mutations on Lin28 inhibition of let-7g maturation in vivo (Fig. 3C). We found a correlation between pre-let-7g binding in vitro and blocking let-7g genesis in vivo. Furthermore, single amino acid substitutions in both the CSD and the CCHC domains abolished both let-7 binding and processing inhibition, thus demonstrating that both domains are necessary for Lin28 function. We found that Lin28 specifically binds the terminal loop region of let-7 miRNA precursors and revealed an unanticipated regulatory role for the loop sequence in let-7 maturation. Although the calculated Kd values for Lin28 binding to pre-let-7g (2.1 μm) and to the terminal loop of let-7g (1.5 μm) are quite high, it is important to consider these affinities relative to those of proteins that compete for binding to the miRNA precursors. For example, the reported Kd of DGCR8 (the essential double-stranded RNA-binding component of the Microprocessor complex) binding to pri-miRNA in vitro is between 2.9 and 4.2 μm (28Sohn S.Y. Bae W.J. Kim J.J. Yeom K.H. Kim V.N. Cho Y. Nat. Struct. Mol. Biol. 2007; 14: 847-853Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar). Therefore, the estimated Kd of Lin28 is lower than that of DGCR8 and is consistent with our previous observation that Lin28 robustly inhibits the pri-miRNA-processing activity of the Microprocessor complex. In addition, it is possible that the conditions we used for the in vitro binding reaction do not precisely reflect the physiological conditions in which Lin28 acts as a blocker, in which case the physiological Kd may be lower. We demonstrate that both the CSD and the CCHC domains are required for the Lin28-mediated block in let-7 processing. Since let-7 miRNA processing is blocked in Lin28-expressing cells, we propose that plasmid-based strategies for ectopic expression of let-7 will be ineffective in certain cell types including embryonic stem cells. Approaches for expressing let-7 in these cells will require changing the pre-let-7 terminal loop sequence to bypass Lin28 regulation. Similarly, vector-based RNA interference has become a popular approach for analyzing gene function in mammalian cells (29Moffat J. Grueneberg D.A. Yang X. Kim S.Y. Kloepfer A.M. Hinkle G. Piqani B. Eisenhaure T.M. Luo B. Grenier J.K. Carpenter A.E. Foo S.Y. Stewart S.A. Stockwell B.R. Hacohen N. Hahn W.C. Lander E.S. Sabatini D.M. Root D.E. Cell. 2006; 124: 1283-1298Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1369) Google Scholar). These vectors use standard promoters to express short-hairpin RNA directed against a target mRNA. Similar designs have incorporated features of miRNA precursors, including the terminal loop sequence. So far, miR-30 and miR-155 have been utilized in this way (30Zeng Y. Wagner E.J. Cullen B.R. Mol. Cell. 2002; 9: 1327-1333Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (696) Google Scholar, 31Silva J.M. Li M.Z. Chang K. Ge W. Golding M.C. Rickles R.J. Siolas D. Hu G. Paddison P.J. Schlabach M.R. Sheth N. Bradshaw J. Burchard J. Kulkarni A. Cavet G. Sachidanandam R. McCombie W.R. Cleary M.A. Elledge S.J. Hannon G.J. Nat. Genet. 2005; 37: 1281-1288Crossref PubMed Scopus (539) Google Scholar, 32Chung K.H. Hart C.C. Al-Bassam S. Avery A. Taylor J. Patel P.D. Vojtek A.B. Turner D.L. Nucleic Acids Res. 2006; 34: e53Crossref PubMed Scopus (260) Google Scholar). Given the newly identified additional level of regulation by Lin28, RNA interference constructs based on pre-let-7 should be avoided for certain applications. It has been reported that Lin28 localizes primarily to the cytoplasm (20Balzer E. Moss E.G. RNA Biol. 2007; 4: 16-25Crossref PubMed Scopus (153) Google Scholar). However, as we recently showed, Lin28 blocks the action of the Microprocessor complex both in vitro and in vivo. Since here we demonstrate that Lin28 specifically binds to the terminal loop region of pre-let-7 miRNA, which is part of both the pri-miRNA and the pre-miRNA, it is possible that Lin28 mediates let-7 processing block by specifically binding pri-let-7 and sequestering these bound pri-miRNAs in the cytoplasm away from the action of the nuclear Microprocessor complex. Lin28 homolog B (Lin28B) up-regulation has been reported in hepatocellular carcinoma, and its overexpression in human breast cancer cells (MCF-7) was shown to stimulate cell proliferation (33Guo Y. Chen Y. Ito H. Watanabe A. Ge X. Kodama T. Aburatani H. Gene (Amst.). 2006; 384: 51-61Crossref PubMed Scopus (235) Google Scholar). Considering that several studies have identified down-regulation of let-7 family miRNAs in various cancers, together with the demonstration that both Lin28 and Lin28B inhibit let-7 processing, it is likely that a better understanding of the mechanism by which Lin28 regulates let-7 biogenesis may facilitate the development of novel cancer therapeutics. It will be important therefore to elucidate the three-dimensional structure of Lin28 together with the let-7 terminal loop to provide a more detailed view of this RNA-protein interaction.

George Daley and colleagues show that transgenic mice expressing elevated levels of Lin28a have increased body size and delayed onset of puberty. These findings support human association studies implicating the LIN28B locus in height variation and timing of menarche. Recently, genome-wide association studies have implicated the human LIN28B locus in regulating height and the timing of menarche1,2,3,4,5. LIN28B and its homolog LIN28A are functionally redundant RNA-binding proteins that block biogenesis of let-7 microRNAs6,7,8,9. lin-28 and let-7 were discovered in Caenorhabditis elegans as heterochronic regulators of larval and vulval development but have recently been implicated in cancer, stem cell aging and pluripotency10,11,12,13. The let-7 targets Myc, Kras, Igf2bp1 and Hmga2 are known regulators of mammalian body size and metabolism14,15,16,17,18. To explore the function of the Lin28–Let-7 pathway in vivo, we engineered transgenic mice to express Lin28a and observed in them increased body size, crown-rump length and delayed onset of puberty. Investigation of metabolic and endocrine mechanisms of overgrowth in these transgenic mice revealed increased glucose metabolism and insulin sensitivity. Here we report a mouse that models the human phenotypes associated with genetic variation in the Lin28–Let-7 pathway.

Nearly all prostate cancer deaths are from metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC), but there have been few whole-genome sequencing (WGS) studies of this disease state. We performed linked-read WGS on 23 mCRPC biopsy specimens and analyzed cell-free DNA sequencing data from 86 patients with mCRPC. In addition to frequent rearrangements affecting known prostate cancer genes, we observed complex rearrangements of the AR locus in most cases. Unexpectedly, these rearrangements include highly recurrent tandem duplications involving an upstream enhancer of AR in 70%-87% of cases compared with <2% of primary prostate cancers. A subset of cases displayed AR or MYC enhancer duplication in the context of a genome-wide tandem duplicator phenotype associated with CDK12 inactivation. Our findings highlight the complex genomic structure of mCRPC, nominate alterations that may inform prostate cancer treatment, and suggest that additional recurrent events in the non-coding mCRPC genome remain to be discovered.

Abstract Sarcomatoid and rhabdoid (S/R) renal cell carcinoma (RCC) are highly aggressive tumors with limited molecular and clinical characterization. Emerging evidence suggests immune checkpoint inhibitors (ICI) are particularly effective for these tumors 1–3 , although the biological basis for this property is largely unknown. Here, we evaluate multiple clinical trial and real-world cohorts of S/R RCC to characterize their molecular features, clinical outcomes, and immunologic characteristics. We find that S/R RCC tumors harbor distinctive molecular features that may account for their aggressive behavior, including BAP1 mutations, CDKN2A deletions, and increased expression of MYC transcriptional programs. We show that these tumors are highly responsive to ICI and that they exhibit an immune-inflamed phenotype characterized by immune activation, increased cytotoxic immune infiltration, upregulation of antigen presentation machinery genes, and PD-L1 expression. Our findings shed light on the molecular drivers of aggressivity and responsiveness to immune checkpoint inhibitors of S/R RCC tumors.