ABSTRACT The elderly population is at significant risk of developing respiratory diseases, including tuberculosis (TB) caused by the airborne Mycobacterium tuberculosis ( M.tb ). Once M.tb reaches the alveolar space, it contacts alveolar lining fluid (ALF) which dictates host cell interactions. We previously determined that age-associated dysfunctionality in human ALF soluble innate components lead to accelerated M.tb growth within human alveolar macrophages. Here we determined the impact of human ALF on M.tb infection of alveolar epithelial cells (ATs), another critical cellular determinant of infection. We observed that E-ALF-exposed M.tb had significantly increased intracellular growth in ATs compared to adult ALF (A-ALF)-exposed bacteria. Despite this, there were no alterations in AT inflammatory mediators or cell activation. However, exposure to E-ALF altered endosomal trafficking of M.tb , driving bacterial translocation to both endosomal and cytosolic compartments in ATs. Our results indicate that exposure of M.tb to E-ALF promotes translocation of bacteria into the AT cytosol as a potential favorable niche for rapid bacterial growth and at the same time dampens AT’s immune responses. Thus, our findings highlight the influence of the elderly lung mucosa on M.tb infection of ATs, an unexplored contributing factor to the elderly population’s increased susceptibility of developing active TB disease.

ABSTRACT Upon infection, Mycobacterium tuberculosis ( M.tb ) reaches the alveolar space and comes in close contact with human alveolar lining fluid (ALF) for an uncertain period of time prior to its encounter with alveolar cells. We showed that homeostatic ALF hydrolytic enzymes modify the M.tb cell envelope, driving M.tb -host cell interactions. Still, the contribution of ALF during M.tb infection is poorly understood. Here, we exposed 4 M.tb strains with different levels of virulence, transmissibility, and drug resistance (DR) to physiological concentrations of human ALF for 15-min and 12-h, and performed RNA sequencing. Gene expression analysis showed a temporal and strain-specific adaptation to human ALF. Differential expression (DE) of ALF-exposed vs. unexposed M.tb revealed a total of 397 DE genes associated with lipid metabolism, cell envelope and processes, intermediary metabolism and respiration, and regulatory proteins, among others. Most DE genes were detected at 12-h post-ALF exposure, with DR- M.tb strain W-7642 having the highest number of DE genes. Interestingly, genes from the KstR2 regulon, which controls the degradation of cholesterol C and D rings, were significantly upregulated in all strains post-ALF exposure. These results indicate that M.tb -ALF contact drives initial metabolic and physiologic changes in M.tb , with potential implications in infection outcome. IMPORTANCE Tuberculosis, caused by airborne pathogen Mycobacterium tuberculosis ( M.tb ), is one of the leading causes of mortality worldwide. Upon infection, M.tb reaches the alveoli and gets in contact with human alveolar lining fluid (ALF), where ALF hydrolases modify the M.tb cell envelope driving subsequent M.tb -host cell interactions. Still, the contributions of ALF during infection are poorly understood. We exposed 4 M.tb strains to ALF for 15-min and 12-h and performed RNA sequencing, demonstrating a temporal and strain-specific adaptation of M.tb to ALF. Interestingly, genes associated with cholesterol degradation were highly upregulated in all strains. This study shows for the first time that ALF drives global metabolic changes in M.tb during the initial stages of the infection, with potential implications in disease outcome. Biologically relevant networks and common and strain-specific bacterial determinants derived from this study could be further investigated as potential therapeutic candidates.

Tuberculosis (TB) infection, caused by the airborne pathogen Mycobacterium tuberculosis ( M . tb ), resulted in almost 1.4 million deaths in 2019 and the number of deaths is predicted to increase by 20% over the next 5 years due to the COVID-19 pandemic. Upon reaching the alveolar space, M . tb comes in close contact with the lung mucosa before and after its encounter with host alveolar compartment cells. Our previous studies show that homeostatic innate soluble components of the alveolar lining fluid (ALF) can quickly alter the cell envelope surface of M . tb upon contact, defining subsequent M . tb -host cell interactions and infection outcomes in vitro and in vivo . We also demonstrated that ALF from 60+ year old elders (E-ALF) vs . healthy 18- to 45-year-old adults (A-ALF) is dysfunctional with loss of homeostatic capacity and impaired innate soluble responses linked to high local oxidative stress. In this study, a targeted transcriptional assay demonstrates that M . tb exposure to human ALF alters the expression of its cell envelope genes. Specifically, our results indicate that A-ALF-exposed M . tb upregulates cell envelope genes associated with lipid, carbohydrate, and amino acid metabolism, as well as genes associated with redox homeostasis and transcriptional regulators. Conversely, M . tb exposure to E-ALF shows lesser transcriptional response, with most of the M . tb genes unchanged or downregulated. Overall, this study indicates that M . tb responds and adapts to the lung alveolar environment upon contact, and that the host ALF status determined by factors such as age might play an important role in determining infection outcome.

Abstract Rationale Mycobacterium avium complex, is the most common nontuberculous mycobacterial respiratory pathogen in humans. Disease mechanisms are poorly understood due to the absence of a reliable animal model for M. avium complex pulmonary disease. Objective Assess the susceptibility, immunologic and histopathologic responses of the common marmoset ( Callithrix jacchus ) to M. avium complex pulmonary infection. Methods 7 adult female marmosets underwent endobronchial inoculation with 10 8 colony-forming units of M. intracellulare and were monitored for 30 or 60 days. Prior to infection, chest radiograph and serum cytokines were assessed; serum cytokines were also monitored weekly for 30 days. At sacrifice 30 days (3 animals) or 60 days (4 animals) after infection, chest radiograph, serum and bronchoalveolar lavage cytokines, histopathology, and cultures of the bronchoalveolar lavage, lungs, liver, and kidney were analyzed. Measurements and Main Results Five of seven animals (two at 30 days and three at 60 days of infection) had positive lung cultures for M. intracellulare . Extra-pulmonary cultures were positive in three animals. All animals appeared healthy throughout the study. All five animals with positive lung cultures had radiographic changes consistent with pneumonitis. At 30 days, those with M. intracellulare lung infection showed granulomatous inflammation while at 60 days there was less inflammatory change, but bronchiectasis was noted. The cytokine response in the bronchoalveolar lavage fluid was uniformly greater in the animals with positive M. intracellulare cultures than those without a productive infection with greater levels at 30-days compared to 60-days. Similarly, serum cytokines were more elevated in the animals that had positive M. intracellulare cultures compared to those without a productive infection, peaking 14-21 days after inoculation. Conclusion Endobronchial instillation of M. intracellulare resulted in pulmonary mycobacterial infection in marmosets with a differential immune response, radiographic and histopathologic abnormalities, and an indolent course consistent with M. avium complex lung infection in humans.