Cellular Electron Cryotomography (CryoET) offers the ability to look inside cells and observe macromolecules frozen in action. A primary challenge for this technique is identifying and extracting the molecular components within the crowded cellular environment. We introduce a method using neural networks to dramatically reduce the time and human effort required for subcellular annotation and feature extraction. Subsequent subtomogram classification and averaging yields in-situ structures of molecular components of interest.

Glioma is the commonest form of primary brain tumor in adults with varying malignancy grades and histological subtypes. Long non-coding RNAs (lncRNAs) are a novel class of non-protein-coding transcripts that have been shown to play important roles in cancer development. To discover novel tumor-related lncRNAs and determine their associations with glioma subtypes, we first applied a lncRNA classification pipeline to identify 1970 lncRNAs that were represented on Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 array. We then analyzed the lncRNA expression patterns in a set of previously published glioma gene expression profiles of 268 clinical specimens, and identified sets of lncRNAs that were unique to different histological subtypes (astrocytic versus oligodendroglial tumors) and malignancy grades. These lncRNAs signatures were then subject to validation in another non-overlapping, independent data set that contained 157 glioma samples. This is the first reported study that correlates lncRNA expression profiles with malignancy grade and histological differentiation in human gliomas. Our findings indicate the potential roles of lncRNAs in the biogenesis, development and differentiation of gliomas, and provide an important platform for future studies.

SUMMARY In the obligate intracellular parasite, Toxoplasma gondii , the subpellicular microtubules (SPMTs) help maintain shape, while the apical conoid (also tubulin-based) is implicated in invasion. Here, we use cryo-electron tomography to determine the molecular structures of the SPMTs and the conoid-fibrils (CFs) in vitrified and detergent-lysed parasites. Subvolume densities from detergent-extracted parasites yielded averaged density maps at subnanometer resolutions, and these were related back to their architecture in situ . An intraluminal spiral (IS) lines the interior of the 13-protofilament SPMTs, revealing a preferred orientation of these microtubules relative to the parasite’s long axis. Each CF is composed of 9 tubulin protofilaments, that produce a comma-shaped cross-section, plus additional associated components. Conoid protrusion, a crucial step in invasion, is associated with an altered pitch of each CF. The use of basic building blocks of protofilaments and different accessory proteins in one organism, illustrates the versatility of these critical structures.

Abstract Host cell invasion by intracellular, eukaryotic parasites within the phylum Apicomplexa, is a remarkable and active process involving the coordinated action of apical organelles and other structures. To date, capturing how these structures interact during invasion has been difficult to observe in detail. Here, we used cryogenic electron tomography to image the apical complex of Toxoplasma gondii tachyzoites under conditions that mimic resting parasites and those primed to invade through stimulation with calcium ionophore. Through the application of Mixed Scale Dense networks for image-processing, we developed a highly efficient pipeline for annotation of tomograms, enabling us to identify and extract densities of relevant subcellular organelles and accurately analyze features in 3D. The results reveal a dramatic change in the shape of the anteriorly located apical vesicle upon its apparent fusion with a rhoptry, that occurs only in the stimulated parasites. We also present information indicating that this vesicle originates from the vesicles that parallel the intraconoidal microtubules and that the latter two structures are linked by a novel tether. We show that a rosette structure previously proposed to be involved in rhoptry secretion is associated with apical vesicles beyond just the most anterior one. This result, suggesting multiple vesicles are primed to enable rhoptry secretion, may shed light on the mechanisms Toxoplasma employs to enable repeated invasion attempts. Using the same approach, we examine Plasmodium falciparum merozoites and show that they too possess an apical vesicle just beneath a rosette, demonstrating evolutionary conservation of this overall subcellular organization. Significance Statement Parasites in the phylum Apicomplexa are responsible for some of the most important parasitic diseases of humans, such as malaria and toxoplasmosis. Invasion by these obligatory, intracellular parasites depends on protein injection into the host cell. Using cryogenic electron tomography, we reveal evolutionarily conserved features shared by the invasive forms of Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii . By comparing resting Toxoplasma tachyzoites with those primed to invade we also gain new insight into the very first steps in invasion. For this work, we take an interdisciplinary approach, adopting a mixed-scale dense neural network that enables efficient and objective processing of the data. Combined, the results provide new information on how these important parasites accomplish the essential step of invasion.

Abstract Intracellular infectious agents, like the malaria parasite, Plasmodium falciparum , face the daunting challenge of how to invade a host cell. This problem may be even harder when the host cell in question is the enucleated red blood cell. Evolution has provided P. falciparum and related single-celled parasites within the phylum Apicomplexa with a collection of organelles at their apical end that mediate invasion. This apical complex includes at least two sets of secretory organelles, micronemes and rhoptries, and several structural features like apical rings and a putative pore through which proteins may be introduced into the host cell during invasion. In this paper, we perform cryogenic electron tomography (cryo-ET) on isolated merozoites to visualize the apical machinery. Through tomography reconstruction of cellular compartments, we see new details of known structures like the rhoptry tip interacting directly with a rosette resembling the recently described rhoptry-secretory-apparatus (RSA), or with an apical vesicle docked beneath the RSA. Subtomogram averaging reveals that the apical rings have a fixed number of repeating units, each of which is similar in overall size and shape to the units in the apical rings of tachyzoites of Toxoplasma gondii . Comparison of these polar rings in Plasmodium and Toxoplasma parasites also reveals them to have a structurally conserved assembly patterning. These results provide new insight into the essential features of this remarkable machinery used by apicomplexan parasites to invade their respective host cells.

Abstract State dependent network models of sub-second interval timing propose that duration is encoded in states of neuronal populations that need to reset prior to a novel timing operation in order to maintain optimal timing performance. Previous research has shown that the approximate boundary of this reset interval can be inferred by varying the interstimulus interval between two to-be-timed intervals. However, the estimated boundary of this reset interval is broad (250-500ms) and remains underspecified with implications for the characteristics of state dependent network dynamics subserving interval timing. Here we probed the interval specificity of this reset boundary by manipulating the interstimulus interval between standard and comparison intervals in two sub-second auditory duration discrimination tasks (100 and 200ms) and a control (pitch) discrimination task using adaptive psychophysics. We found that discrimination thresholds improved with the introduction of a 333ms interstimulus interval relative to a 250ms interstimulus interval in both duration discrimination tasks, but not in the control task. This effect corroborates previous findings of a breakpoint in the discrimination performance for sub-second stimulus interval pairs as a function of an incremental interstimulus delay but more precisely localizes the minimal interstimulus delay range. These results suggest that state dependent networks subserving sub-second timing require approximately 250-333ms for the network to reset in order to maintain optimal interval timing. New & Noteworthy The state-dependent-network model considers interval timing as an intrinsic ability of neuronal populations to track the temporal evolution of their collective state. However, the time-dependent nature of neuronal properties imposes constraints on a maximum encodable interval and on the processing of intervals that are presented before the network resets to its baseline state. Investigating temporal discrimination thresholds as a function of variable inter-stimulus-intervals, we showed that the network reset time is between 250 and 333ms.

ABSTRACT Arl13b and Arl3 are ciliary GTPases implicated in human Joubert Syndrome, affecting ciliary membrane and axoneme organization. Although the mechanism of Arl13b as a guanine nucleotide exchange factor (GEF) of Arl3 and the function of Arl13b and Arl3 in ciliary membrane protein transport are well established, their role in axoneme biogenesis is unclear. In Trypanosoma brucei , TbArl13 acts as a GEF for two distinct TbArl3 proteins, TbArl3A and TbArl3C. Here, we identified the T. brucei homolog of ODA16, a cargo adapter facilitating intraflagellar transport (IFT) of motile ciliary components, as an effector of both TbArl3A and TbArl3C. Depletion of TbArl3 GTPases stabilized TbODA16 interaction with IFT, while active TbArl3 variants displaced TbODA16 from IFT, demonstrating a mechanism of TbArl3 in motile ciliary cargo transport. One-sentence summary Arl3 acts as a displacement factor and releases ODA16 from IFT

Eukaryotic cilia and flagella are essential for cell motility and sensory functions. Their biogenesis and maintenance rely on the intraflagellar transport (IFT). Several cargo adapters have been identified to aid IFT cargo transport, but how ciliary cargos are discharged from the IFT remains largely unknown. During our explorations of small GTPases ARL13 and ARL3 in Trypanosoma brucei , we found that ODA16, a known IFT cargo adapter present exclusively in motile cilia, is a specific effector of ARL3. In the cilia, active ARL3 GTPases bind to ODA16 and dissociate ODA16 from the IFT complex. Depletion of ARL3 GTPases stabilizes ODA16 interaction with the IFT, leading to ODA16 accumulation in cilia and defects in axonemal assembly. The interactions between human ODA16 homolog HsDAW1 and ARL GTPases are conserved, and these interactions are altered in HsDAW1 disease variants. These findings revealed a conserved function of ARL GTPases in IFT transport of motile ciliary components, and a mechanism of cargo unloading from the IFT.