Abstract Pseudoachondroplasia (PSACH), a short limb skeletal dysplasia, associated with premature joint degeneration is caused by misfolding mutations in cartilage oligomeric matrix protein (COMP). Here, we define mutant-COMP-induced stress mechanisms that occur in articular chondrocytes of MT-COMP mice, a murine model of PSACH. The accumulation of mutant-COMP in the ER occurred early in MT-COMP articular chondrocytes and stimulated inflammation (TNFα) at 4 wks. Articular chondrocyte death increased at 8 wks and ER stress through CHOP was elevated by 12 wks. Importantly, blockage of autophagy (pS6), the major mechanism which clears the ER, sustained cellular stress in MT-COMP articular chondrocytes. Degeneration of MT-COMP articular cartilage was similar to that observed in PSACH and was associated with increased MMPs, degradative enzymes. Moreover, chronic cellular stresses stimulated senescence. Senescence-associated secretory phenotype (SASP) may play a role in generating and propagating a pro-degradative environment in the MT-COMP murine joint. The loss of CHOP or resveratrol treatment from birth preserved joint health in MT-COMP mice. Taken together, these results indicate that ER stress/CHOP signaling and autophagy blockage are central to mutant-COMP joint degeneration and MT-COMP mice joint health can be preserved by decreasing articular chondrocyte stress. Future joint sparing therapeutics for PSACH may include resveratrol.

ABSTRACT Facial development requires a complex and coordinated series of cellular events, that when perturbed, can lead to structural birth defects. A standardized quantitative approach to quickly assess morphological changes could address how genetic or environmental inputs lead to differences in facial development. Here we report on a method to rapidly analyze craniofacial development in zebrafish embryos that combines a simple staining and mounting paradigm with F acial A nalytics based on a C oordinate E xtrapolation system, termed zFACE. Confocal imaging of frontal/rostral mounted embryos generates high-resolution images to capture facial structures and morphometric data is quantified based on a coordinate system that assesses 26 anatomical landmarks present at defined times in development. The semi-automated analysis can be applied to embryos at different stages of development and quantitative morphometric data can detect subtle phenotypic variation. Shape analysis can also be performed with the coordinate data to inform on global changes in facial morphology. We applied this new approach to show that loss of smarca4a in developing zebrafish leads to craniofacial anomalies, microcephaly and alterations in brain morphology. These changes are characteristic of humans with Coffin-Siris syndrome (CSS), a rare genetic disorder associated with mutations in SMARCA4 that is defined by anomalies in head size, intellectual disabilities and craniofacial abnormalities. We observed that smarca4a is expressed in craniofacial tissues and our multivariate analysis facilitated the classification of smarca4a mutants based on changes in specific phenotypic characteristics. Together, our approach provides a way to rapidly and quantitatively assess the impact of genetic alterations on craniofacial development in zebrafish.

Abstract Misfolding mutations in cartilage oligomeric matrix protein (COMP) cause it to be retained within in ER of chondrocytes, stimulating a multitude of damaging cellular responses including ER stress, inflammation and oxidative stress which ultimately culminates in the death of growth plate chondrocytes and pseudoachondroplasia (PSACH). Previously, we demonstrated that an antioxidant, resveratrol, substantially reduces the intracellular accumulation of mutant COMP, dampens cellular stress and lowers the level of growth plate chondrocyte death. In addition, we showed that resveratrol reduces mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) signaling, suggesting a potential mechanism. In this work, we investigate the role of autophagy in treatment of COMPopathies. In cultured chondrocytes expressing wild type or mutant COMP (MT-COMP), resveratrol significantly increased the number of large LC3 vesicles, directly demonstrating that resveratrol stimulated autophagy is an important component of the resveratrol-driven mechanism responsible for the degradation of mutant COMP. Moreover, pharmacological inhibitors of autophagy suppressed degradation of MT-COMP in our established mouse model of PSACH. In contrast, blockage of the proteasome did not substantially alter resveratrol clearance of mutant COMP from growth plate chondrocytes. Mechanistically, resveratrol increased SIRT1 and PP2A expression and reduced MID1 expression and activation of pAKT and mTORC1 signaling in growth plate chondrocytes, allowing clearance of mutant COMP by autophagy. Importantly, we show that optimal reduction in growth plate pathology, including decreased mutant COMP retention, decreased mTORC1 signaling and restoration of chondrocyte proliferation was attained when treatment was initiated between birth to one week of age in MT-COMP mice, translating to birth to approximately 2 years of age in PSACH children. These results clearly demonstrate that resveratrol stimulates clearance of mutant COMP by an autophagy-centric mechanism.

Orofacial clefts (OFCs) are one of the most common birth defects worldwide and create a significant health burden. The majority of OFCs are non-syndromic, and the genetic component has been only partially determined. Here, we analyze whole genome sequence (WGS) data for association with risk of OFCs in European and Colombian families selected from a multicenter family-based OFC study. Part of the Gabriella Miller Kids First Pediatric Research Program, this is the first large-scale WGS study of OFC in parent-offspring trios. WGS provides deeper and more specific genetic data than currently available using imputation on single nucleotide polymorphic (SNP) marker panels. Here, association analysis of genome-wide single nucleotide variants (SNV) and short insertions and deletions (indels) identified a new locus on chromosome 21 in Colombian families, within a region known to be expressed during craniofacial development. This study reinforces the ancestry differences seen in the genetic etiology of OFCs, and the need for larger samples when for studying OFCs and other birth defects in admixed populations.

Phenotypic heterogeneity is a hallmark of complex traits, and genetic studies of such traits may focus on them as a single diagnostic entity or by analyzing specific components. For example, in orofacial clefting (OFC), three subtypes – cleft lip (CL), cleft lip and palate (CLP), and cleft palate (CP) have been studied separately and in combination. To further dissect the genetic architecture of OFCs and how a given associated locus may be contributing to distinct subtypes of a trait we developed a framework for quantifying and interpreting evidence of subtype-specific or shared genetic effects in complex traits. We applied this technique to create a “cleft map” of the association of 30 genetic loci with three OFC subtypes. In addition to new associations, we found loci with subtype-specific effects (e.g., GRHL3 (CP), WNT5A (CLP)), as well as loci associated with two or all three subtypes. We cross-referenced these results with mouse craniofacial gene expression datasets, which identified additional promising candidate genes. However, we found no strong correlation between OFC subtypes and expression patterns. In aggregate, the cleft map revealed that neither subtype-specific nor shared genetic effects operate in isolation in OFC architecture. Our approach can be easily applied to any complex trait with distinct phenotypic subgroups.

Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) is the most common craniofacial birth defect in humans and is notable for its apparent sexual dimorphism where approximately twice as many males are affected as females. The sources of this disparity are largely unknown, but interactions between genetic and sex effects are likely contributors. We examined gene-by-sex (G x S) interactions in a worldwide sample of 2,142 NSCL/P cases and 1,700 controls recruited from 13 countries. First, we performed genome-wide joint tests of the genetic (G) and G x S effects genome-wide using logistic regression assuming an additive genetic model and adjusting for 18 principal components of ancestry. We further interrogated loci with suggestive results from the joint test (p < 1.00x10-5) by examining the G x S effects from the same model. Out of the 133 loci with suggestive results (p < 1.00x10-5) for the joint test, we observed one genome-wide significant G x S effect in the 10q21 locus (rs72804706; p = 6.69x10-9; OR = 2.62 [1.89, 3.62]) and 16 suggestive G x S effects. At the intergenic 10q21 locus, the risk of NSCL/P is estimated to increase with additional copies of the minor allele for females, but the opposite effect for males. Our observation that the impact of genetic variants on NSCL/P risk differs for males and females may further our understanding of the genetic architecture of NSCL/P and the sex differences underlying clefts and other birth defects.

Abstract Craniofacial development is a complex and tightly regulated process and disruptions can lead to structural birth defects, the most common being nonsyndromic cleft lip and palate (NSCLP). Previously, we identified FOS as a candidate regulator of NSCLP through family-based association studies, yet its specific contributions to oral and palatal formation are poorly understood. This study investigated the role of fos during zebrafish craniofacial development through genetic disruption and knockdown approaches. Fos was expressed in the periderm, olfactory epithelium and other cell populations in the head. Genetic perturbation of fos produced an abnormal craniofacial phenotype with a hypoplastic oral cavity that showed significant changes in midface dimensions by quantitative facial morphometric analysis. Loss and knockdown of fos caused increased cell apoptosis in the head, followed by a significant reduction in cranial neural crest cells (CNCCs) populating the upper and lower jaws. These changes resulted in abnormalities of cartilage, bone and pharyngeal teeth formation. Periderm cells surrounding the oral cavity showed altered morphology and a subset of cells in the upper and lower lip showed disrupted Wnt/β-catenin activation, consistent with modified inductive interactions between mesenchymal and epithelial cells. Taken together, these findings demonstrate that perturbation of fos has detrimental effects on oral epithelial and CNCC-derived tissues suggesting that it plays a critical role in zebrafish craniofacial development and a potential role in NSCLP. Summary statement Perturbation of fos , a candidate gene associated with nonsyndromic cleft lip and palate in humans, causes a distinctive orofacial phenotype in zebrafish as a result of abnormal development of craniofacial tissues. Disruption of fos in the oral epithelial, cranial neural crest and Wnt responsive cell populations around the oral cavity causes anomalies that suggest a potential role in the etiology of NSCLP.