Abstract Previously, we described a large collection of Drosophila strains that each carry an artificial exon containing a T2AGAL4 cassette inserted in an intron of a target gene based on CRISPR-mediated homologous recombination (Lee et al ., 2018). These alleles permit numerous applications and have proven to be very useful. Initially, the homologous recombination-based donor constructs had long homology arms (>500 bps) to promote precise integration of large constructs (>5kb). Recently, we showed that in vivo linearization of the donor constructs enables insertion of large artificial exons in introns using short homology arms (100-200 bps) (Kanca et al ., 2019a). Shorter homology arms make it feasible to commercially synthesize homology donors and minimize the cloning steps for donor construct generation. Unfortunately, about 50% of Drosophila genes lack suitable coding introns for integration of artificial exons. Here, we report the development of new set of constructs that allow the replacement of the coding region of genes that lack suitable introns with a KozakGAL4 cassette, generating a knock-out/knock-in allele that expresses GAL4 similarly as the targeted gene. We also developed custom vector backbones to further facilitate and improve transgenesis. Synthesis of homology donor constructs in custom plasmid backbones that contain the target gene sgRNA obviates the need to inject a separate sgRNA plasmid and significantly increases the transgenesis efficiency. These upgrades will enable the targeting of nearly every fly gene, regardless of exon-intron structure, with a 70-80% success rate.

We previously reported a CRISPR-mediated knock-in strategy into introns of Drosophila genes, generating an attP - FRT-SA-T2A-GAL4-polyA-3XP3-EGFP-FRT-attP transgenic library for multiple uses (Lee et al., 2018b). The method relied on double stranded DNA (dsDNA) homology donors with ~1 kb homology arms. Here, we describe three new simpler ways to edit genes in flies. We create single stranded DNA (ssDNA) donors using PCR and add 100 nt of homology on each side of an integration cassette, followed by enzymatic removal of one strand. Using this method, we generated GFP-tagged proteins that mark organelles in S2 cells. We then describe two dsDNA methods using cheap synthesized donors flanked by 100 nt homology arms and gRNA target sites cloned into a plasmid. Upon injection, donor DNA (1 to 5 kb) is released from the plasmid by Cas9. The cassette integrates efficiently and precisely in vivo . The approach is fast, cheap, and scalable.

ABSTRACT Background The skin microbiota, a complex community of microorganisms residing on the skin, plays a crucial role in maintaining skin health and overall homeostasis. Recent research has suggested that alterations in the composition and function of the skin microbiota may influence the aging process. However, the causal relationships between specific skin microbiota and biological aging remain unclear. Mendelian randomization (MR) analysis provides a powerful tool to explore these causal links by utilizing genetic variants as instrumental variables, thereby minimizing confounding factors and reverse causality that often complicate observational studies. Methods We utilized a two‐sample MR approach with population‐based cross‐sectional data from two German cohorts, KORA FF4 ( n = 324) and PopGen ( n = 273). In total, GWAS summary data from 1656 skin samples and datasets on accelerated biological age were analyzed to investigate the causal relationship between skin microbiota and accelerated biological aging. The primary analysis was performed using the inverse variance weighted (IVW) method with random effects and was further supported by MR‐Egger regression, Cochran's Q test, and a range of sensitivity analyses. Results The MR analysis revealed that for biological age acceleration (BioageAccel), the IVW analysis identified protective effects from certain skin microbiota, including Alphaproteobacteria_Dry ( p = 0.046), Asv033_sebaceous ( p = 0.043), Burkholderiales_Moist ( p = 0.008), and Proteobacteria_Moist ( p = 0.042). Similar protective effects were observed for Burkholderiales_Moist ( p = 0.045) and Proteobacteria_Moist ( p = 0.012) in the weighted median analysis. In contrast, Paracoccus_Moist ( p = 0.013) and Proteobacteria_Sebaceous ( p = 0.005) were associated with accelerated aging. When using PhenoAge acceleration as the outcome, the IVW analysis linked skin microbiota like Asv005_Dry ( p = 0.026), ASV039_Dry ( p = 0.003), Betaproteobacteria_Sebaceous ( p = 0.038), and Chryseobacterium_Moist ( p = 0.013) with accelerated aging. The weighted median analysis supported these findings and also identified protective effects from ASV011_Dry ( p = 0.021), ASV023_Dry ( p = 0.040), Bacteroidales_Dry ( p = 0.022), Enhydrobacter_Moist ( p = 0.038), Proteobacteria_Moist ( p = 0.002), and Rothia_Moist ( p = 0.038). Conclusions This two‐sample MR study reveals potential causal relationships between skin microbiota and aging. However, to confirm these findings, further randomized controlled trials (RCTs) are necessary.