Abstract With an ever-increasing amount of (meta)genomic data being deposited in sequence databases, (meta)genome mining for natural product biosynthetic pathways occupies a critical role in the discovery of novel pharmaceutical drugs, crop protection agents and biomaterials. The genes that encode these pathways are often organised into biosynthetic gene clusters (BGCs). In 2015, we defined the Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster (MIBiG): a standardised data format that describes the minimally required information to uniquely characterise a BGC. We simultaneously constructed an accompanying online database of BGCs, which has since been widely used by the community as a reference dataset for BGCs and was expanded to 2021 entries in 2019 (MIBiG 2.0). Here, we describe MIBiG 3.0, a database update comprising large-scale validation and re-annotation of existing entries and 661 new entries. Particular attention was paid to the annotation of compound structures and biological activities, as well as protein domain selectivities. Together, these new features keep the database up-to-date, and will provide new opportunities for the scientific community to use its freely available data, e.g. for the training of new machine learning models to predict sequence-structure-function relationships for diverse natural products. MIBiG 3.0 is accessible online at https://mibig.secondarymetabolites.org/.

Abstract In eukaryotes, N 6 -methyladenosine (m 6 A) RNA modification plays crucial roles in governing the fate of RNA molecules and has been linked to various developmental processes. However, the phyletic distribution and functions of genetic factors responsible for m 6 A modification remain largely unexplored in fungi. To get insights into evolution of m 6 A machineries, we reconstructed global phylogenies of potential m 6 A writers, readers, and erasers in fungi. Substantial copy number variations were observed, ranging from up to five m 6 A writers in early-diverging fungi to a single copy in the subphylum Pezizomycotina, which primarily comprises filamentous fungi. To characterize m 6 A factors in a phytopathogenic fungus Fusarium graminearum , we generated knockout mutants lacking potential m 6 A factors including the sole m 6 A writer MTA1 . However, the resulting knockouts did not exhibit any noticeable phenotypic changes during vegetative and sexual growth stages. As obtaining a homozygous knockout lacking MTA1 was likely hindered by its essential role, we generated MTA1 -overexpressing strains ( MTA1 -OE). The MTA1 -OE5 strain showed delayed conidial germination and reduced hyphal branching, suggesting its involvement during vegetative growth. Consistent with these findings, the expression levels of MTA1 and a potential m 6 A reader YTH1 were dramatically induced in germinating conidia, followed by the expression of potential m 6 A erasers at later vegetative stages. Several genes including transcription factors, transporters and various enzymes were found to be significantly up- and down-regulated in the MTA1 -OE5 strain. Overall, our study highlights the functional importance of the m 6 A methylation during conidial germination in F. graminearum and provides a foundation for future investigations into m 6 A modification sites in filamentous fungi. Importance N 6 -methyladenosine (m 6 A) RNA methylation is a reversible posttranscriptional modification that regulates RNA function and plays a crucial role in diverse developmental processes. This study addresses the knowledge gap regarding phyletic distribution and functions of m 6 A factors in fungi. The identification of copy number variations among fungal groups enriches our knowledge regarding the evolution of m 6 A machinery in fungi. Functional characterization of m 6 A factors in a phytopathogenic filamentous fungus Fusarium graminearum provides insights into the essential role of the m 6 A writer MTA1 in conidial germination and hyphal branching. The observed effects of overexpressing MTA1 on fungal growth and gene expression patterns of m 6 A factors throughout the life cycle of F. graminearum further underscore the importance of m 6 A modification in conidial germination. Overall, this study significantly advances our understanding of m 6 A modification in fungi, paving the way for future research into its roles in filamentous growth and potential applications in disease control.

Hfq is the bacterial orthologue of the eukaryotic (L)Sm family of proteins found across all domains of life and potentially an ancient protein, but it has not been found in all phyletic lines. A careful search successfully identified a distant hfq orthologue in the cyanobacteria leaving the actinobacteria as the major phylum with no known hfq orthologue. A search for hfq in actinobacteria, using domain enhanced searching (DELTA-BLAST) with cyanobacterial hfq, identified a conserved actinobacterial specific protein as remotely homologous. Structural homology modelling using profile matching to fold libraries and ab initio 3D structure determination supports this prediction and suggests module shuffling in the evolution of the actinobacterial hfq. Our results provide the basis to explore this prediction, and exploit it, across diverse taxa with potentially important post-transcriptional regulatory effects in virulence, antibiotic production and interactions in human microbiomes. However, the role of hfq in gram positive bacteria has remained elusive and experimental verification will be challenging.

Long noncoding RNA (lncRNA) plays important roles in morphological differentiation and development in eukaryotes. In filamentous fungi, however, little is known about lncRNAs and their roles in sexual development. Here we describe sexual stage-induced lncRNAs during the formation of perithecia, the sexual fruiting bodies of Fusarium graminearum. We have identified 547 lncRNAs whose expression was developmental stage-specific, with about 40% of which peaked during the development of asci, the sac-like structures containing meiospores. A large fraction of the lncRNAs were found to be antisense to mRNAs, forming 300 sense-antisense pairs. Although small RNAs (sRNAs) were produced from these overlapping loci, most of the antisense lncRNAs appeared not to be involved in gene silencing pathways. Genome-wide analysis of sRNA clusters identified many silenced loci at the meiotic stage. However, we found transcriptionally-active sRNA clusters, many of which were associated with lncRNAs. Also, we observed that many antisense lncRNAs and their respective sense transcripts were induced in parallel as the perithecia matured. To identify regulatory components for lncRNA expression, we analyzed mutants defective in the nonsense-mediated decay (NMD) pathway. A subset of the lncRNAs appeared to be targeted by the NMD before the perithecia formation, suggesting a suppressive role of the NMD in lncRNA expression during vegetative stage. This research provides fundamental genomic resources that will spur further investigations on developmental lncRNAs that may play important roles in shaping the fungal fruiting bodies.

ABSTRACT Transcription factors (TFs) involved in sexual reproduction in filamentous fungi have been characterized. However, we have little understanding of how these TFs synergize within regulatory networks resulting in sexual development. We investigated 13 TFs in Fusarium graminearum , whose knockouts exhibited abortive or arrested phenotypes during sexual development to elucidate the transcriptional regulatory cascade underlying the development of the sexual fruiting bodies. A Bayesian network of the TFs was inferred based on transcriptomic data from key stages of sexual development. We evaluated in silico knockout impacts to the networks of the developmental phenotypes among the TFs and guided knockout transcriptomics experiments to properly assess regulatory roles of genes with same developmental phenotypes. Additional transcriptome data were collected for the TF knockouts guided by the stage at which their phenotypes appeared and by the cognate in silico prediction. Global TF networks revealed that TFs within the mating-type locus ( MAT genes) trigger a transcriptional cascade involving TFs that affected early stages of sexual development. Notably, PNA1 , whose knockout mutants produced exceptionally small protoperithecia, was shown to be an upstream activator for MAT genes and several TFs essential for ascospore production. In addition, knockout mutants of SUB1 produced excessive numbers of protoperithecia, wherein MAT genes and pheromone-related genes exhibited dysregulated expression. We conclude that PNA1 and SUB1 play central and suppressive roles in initiating sexual reproduction, respectively. This comprehensive investigation contributes to our understanding of the transcriptional framework governing the multicellular body plan during sexual reproduction in F. graminearum . IMPORTANCE Understanding transcriptional regulation of sexual development is crucial to the elucidation of the complex reproductive biology in Fusarium graminearum . We performed gene knockouts on 13 transcription factors (TFs), demonstrating knockout phenotypes affecting distinct stages of sexual development. Using transcriptomic data across stages of sexual development, we inferred a Bayesian network of these TFs that guided experiments to assess the robustness of gene interactions using a systems biology approach. We discovered that the mating-type locus ( MAT genes) initiates a transcriptional cascade, with PNA1 identified as an upstream activator essential for early sexual development and ascospore production. Conversely, SUB1 was found to play a suppressive role, with knockout mutants exhibiting excessive protoperithecia due to abnormally high expression of MAT and pheromone-related genes. These findings highlight the central roles of PNA1 and SUB1 in regulating other gene activity related to sexual reproduction, contributing to a deeper understanding of the mechanisms of the multiple TFs that regulate sexual development.