Abstract Single-cell transcriptome profiling of tumour tissue isolates allows the characterization of heterogeneous tumour cells along with neighbouring stromal and immune cells. Here we adopt this powerful approach to breast cancer and analyse 515 cells from 11 patients. Inferred copy number variations from the single-cell RNA-seq data separate carcinoma cells from non-cancer cells. At a single-cell resolution, carcinoma cells display common signatures within the tumour as well as intratumoral heterogeneity regarding breast cancer subtype and crucial cancer-related pathways. Most of the non-cancer cells are immune cells, with three distinct clusters of T lymphocytes, B lymphocytes and macrophages. T lymphocytes and macrophages both display immunosuppressive characteristics: T cells with a regulatory or an exhausted phenotype and macrophages with an M2 phenotype. These results illustrate that the breast cancer transcriptome has a wide range of intratumoral heterogeneity, which is shaped by the tumour cells and immune cells in the surrounding microenvironment.

A spatially resolved analysis of the heterogeneous cancer genome, in which the data are connected to the three-dimensional space of a tumour, is crucial to understand cancer biology and the clinical impact of cancer heterogeneity on patients. However, despite recent progress in spatially resolved transcriptomics, spatial mapping of genomic data in a high-throughput and high-resolution manner has been challenging due to current technical limitations. Here, we describe a novel approach, phenotype-based high-throughput laser-aided isolation and sequencing (PHLI-seq), which enables high-throughput isolation of a single-cell or a small number of cells and their genome-wide sequence analysis to construct genomic maps within cancer tissue in relation to the phenotypes of the cells. By applying PHLI-seq, we reveal the heterogeneity of breast cancer tissues at a high resolution and map the genomic landscape of the cells to their corresponding spatial locations and phenotypes in the tumour mass. Additionally, with different staining modalities, the genotypes of the cells can be connected to corresponding phenotypic information of the tissue. Together with the spatially resolved genomic analysis, we can infer the histories of heterogeneous cancer cells in two or three dimensions, providing significant insight into cancer biology and precision medicine.

To understand the potential effects of cancer cells on surrounding normal mammary epithelial cells, we performed direct co-culture of non-tumorigenic mammary epithelial MCF10A cells and various breast cancer cells. Firstly, we observed dynamic cell-cell interactions between the MCF10A cells and breast cancer cells including lamellipodia or nanotube-like contacts and transfer of extracellular vesicles. Co-cultured MCF10A cells exhibited features of epithelial-mesenchymal transition, and showed increased capacity of cell proliferation, migration, colony formation, and 3-dimensional sphere formation. Transcriptome analysis and phosphor-protein array suggested that several cancer-related pathways are significantly dysregulated in MCF10A cells after the direct co-culture with breast cancer cells. S100A8 and S100A9 showed distinct up-regulation in the co-cultured MCF10A cells and their microenvironmental upregulation was also observed in the orthotropic xenograft of syngeneic mouse mammary tumors. When S100A8/A9 overexpression was induced in MCF10A cells, the cells showed phenotypic features of directly co-cultured MCF10A cells in terms of in vitro cell behaviors and signaling activities suggesting a S100A8/A9-mediated transition program in non-tumorigenic epithelial cells. This study suggests the possibility of dynamic cell-cell interactions between non-tumorigenic mammary epithelial cells and breast cancer cells that could lead to a substantial transition in molecular and functional characteristics of mammary epithelial cells.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

e13645 Background: Survivors of breast cancer are at an elevated risk for developing contralateral breast cancer (CBC), a risk that surpasses the incidence of initial primary breast cancer within the general population. Consequently, annual mammography screenings are advocated to monitor for ipsilateral recurrence and the emergence of CBC. However, the sensitivity of surveillance mammography exhibits considerable variation, ranging between 45% and 90%, with notably lower detection rates in younger individuals and those with dense breast tissue. This study explores the efficacy of an artificial intelligence (AI) detection algorithm in mammography for the early identification of CBC prior to the official diagnosis. Methods: A retrospective analysis was conducted on patients treated for primary breast cancer from 2000 to 2021 at Seoul National University Hospital. This involved reviewing serial mammograms post-surgery and adjuvant therapy from 460 patients who subsequently developed CBC (CBC group) and 469 patients who did not (control group). These mammograms were evaluated using the Lunit INSIGHT mammogram AI system, which provides a pixel-level abnormality score between 0 and 100, with higher scores indicating increased abnormality. Scores exceeding 10 were considered indicative of CBC, reflecting a 90% sensitivity based on the AI software's tuning dataset. The diagnostic accuracy of AI-assisted mammography was then juxtaposed with that of specialist radiologists' evaluations. Results: At the point of CBC diagnosis, the median AI abnormality score was markedly higher in the CBC group (22.9 [IQR, 2.1-81.1]) compared to the control group's final follow-up mammogram (0.4 [IQR, 0.1-1.5], p<0.001). The AI system's sensitivity for CBC detection paralleled that of radiologist assessments (59.6% for AI vs. 56.5% for radiologists out of 460 detected cancers), with the AI method achieving an AUROC of 0.836 and a specificity of 91.0%. Notably, AI detected 84 cases (30.7%) at least six months and 59 cases (21.5%) more than a year before the official CBC diagnosis. Conclusions: The application of AI in mammography screening has demonstrated significant potential for the early detection of CBC, identifying cases up to a year before formal diagnosis. This underscores the value of integrating AI tools in mammography to enhance early detection rates of CBC among primary breast cancer patients.

595 Background: Neoadjuvant therapy significantly enhances the likelihood of breast-conserving surgery (BCS) in breast cancer patients. However, in ER-positive and HER-2 negative breast cancer, the response to neoadjuvant chemotherapy (NCT) is not as good as HER-2 positive or triple-negative breast cancer. In addition, with the evolution of multi-gene assays, many patients of this subtype may not require adjuvant chemotherapy. This study explores the potential of tailored neoadjuvant treatments (NCT or endocrine therapy (NET)) guided by 70-gene assay (Mammaprint, Agendia) to improve BCS rates in ER-positive/HER-2 negative breast cancer. Methods: A prospective, multicenter cohort study was conducted across four Korean centers from 2019 to 2023. Participants were clinical stage II-IIIA, ER-positive/HER2-negative breast cancer patients deemed unsuitable for BCS. Suitability was further verified by an independent three-surgeon panel using mammography or MRI. Out of 130 screened patients, 100 were enrolled. We analyzed 90 patients, excluding 10 cases; 2 with a basal type or HER2 type result in the blueprint, 7 who refused neoadjuvant therapy, and 1 who underwent surgery at another hospital. Before initiation of therapy, each surgeon recorded a target tumor size at which the surgeon would be able to do BCS considering location of the tumor and patient’s breast size. Based on the 70-gene assay results from core needle biopsies, high-genomic-risk patients received NCT (anthracycline + cyclophosphamide for 4 cycles, followed by 4 cycles of docetaxel), while low-risk patients underwent 16 weeks of NET with letrozole (±leuprolide for premenopausal women). Results: Out of the patients, 66 (73%) were high-genomic-risk and underwent NCT, while 24 (27%) received NET. Median tumor size was 3.7cm (85.6% clinical T2 and 14.4% T3/4). The primary endpoint, achieving the pre-established target tumor size for BCS, was reached by 70.0% (95% CI: 59.4-79.2%) of patients, significantly surpassing the set goal of 50.8% (a 15% increase from historical control). The rates were 74.2% for NCT and 58.3% for NET. The actual BCS rate was 58.9% overall (63.6% for NCT and 45.8% for NET). Clinically, 5.6% exhibited complete response (CR), 74.4% partial response (PR), 18.8% stable disease (SD), and 1.1% progressive disease (PD). Pathologic complete response (pCR) was achieved in 2.2% (all in the NCT group). No severe adverse events beyond expectations were observed. No pre-treatment clinical or pathological factor was significantly predictive for the BCS conversion. Conclusions: For ER positive, HER2 negative breast cancer patients initially ineligible for BCS, the use of pre-treatment multi-gene assays to guide selective NCT or NET could substantially increase BCS rates and reduce unnecessary chemotherapy. Clinical trial information: NCT03900637 .

Introduction: The role of adipocytes in cancer microenvironment has gained focus during the recent years. However, the characteristics of the cancer-associated adipocytes (CAA) in human breast cancer tissues and the underlying regulatory mechanism are not clearly understood. Method: We reviewed pathology specimens of breast cancer patients to understand the morphologic characteristics of CAA, and profiled the mRNA and miRNA expression of CAA by using indirect co-culture system in vitro. Results: The CAAs in human breast cancers showed heterogeneous topographic relationship with breast cancer cells within the breast microenvironment. The CAAs exhibited the characteristics of de-differentiation determined by their microscopic appearance and the expression levels of adipogenic markers. Additionally, the 3T3-L1 adipocytes co-cultured with breast cancer cells showed up-regulation of inflammation-related genes including Il6 and Ptx3. The up-regulation of IL6 in CAA was further observed in human breast cancer tissues. miRNA array of co-cultured 3T3-L1 cells showed increased expression of mmu-miR-5112 which may target Cpeb1. Cpeb1 is a negative regulator of Il6. The suppressive role of mmu-miR-5112 was confirmed by dual luciferase reporter assay, and mmu-miR-5112-treated adipocytes showed up-regulation of Il6. The transition of adipocytes into more inflammatory CAA resulted in proliferation-promoting effect in ER positive breast cancer cells such as MCF7 and ZR-75-1 but not in ER negative cells. Conclusion: In this study, we have determined the de-differentiated and inflammatory natures of CAA in breast cancer microenvironment. Additionally, we propose a miRNA-based regulatory mechanism underlying the process of acquiring inflammatory phenotypes in CAA.