Ever since Stephen Paget’s 1889 hypothesis, metastatic organotropism has remained one of cancer’s greatest mysteries. Here we demonstrate that exosomes from mouse and human lung-, liver- and brain-tropic tumour cells fuse preferentially with resident cells at their predicted destination, namely lung fibroblasts and epithelial cells, liver Kupffer cells and brain endothelial cells. We show that tumour-derived exosomes uptaken by organ-specific cells prepare the pre-metastatic niche. Treatment with exosomes from lung-tropic models redirected the metastasis of bone-tropic tumour cells. Exosome proteomics revealed distinct integrin expression patterns, in which the exosomal integrins α6β4 and α6β1 were associated with lung metastasis, while exosomal integrin αvβ5 was linked to liver metastasis. Targeting the integrins α6β4 and αvβ5 decreased exosome uptake, as well as lung and liver metastasis, respectively. We demonstrate that exosome integrin uptake by resident cells activates Src phosphorylation and pro-inflammatory S100 gene expression. Finally, our clinical data indicate that exosomal integrins could be used to predict organ-specific metastasis. Exosomes originating from lung-, liver- and brain-tropic tumour cells are preferentially incorporated by specific resident cells of the target organs, thus preparing the site for metastasis; the expression of distinct combinations of exosomal integrin proteins determines the exosomal targeting to each of the three organs, and blocking these integrins reduces organotropic exosome uptake by the target organs, thereby reducing the likelihood of organotropic metastasis. How do cancer cells choose the next organ to target? David Lyden and colleagues show that extracellular vesicles (exosomes) that originate from tumour cells can preferentially fuse with specific resident cells of the target organs — lung, liver and brain — to prepare the site of metastasis. At a molecular level, expression of distinct combinations of integrin proteins on exosomes seems to mediate their targeting to one of the three organs. By blocking these integrins, the authors could reduce the uptake of the associated exosomes by the target organs and so the likelihood of metastasis. Moreover, the exosomal integrins could be used to predict organ-specific metastasis in cancer patients.

Exosomes can transfer proteins and nucleic acids from one cell to another, altering the phenotype of the recipient cell. In the case of cancer, tumor-derived exosomes have been shown to promote tumor cell proliferation. Now, in a mouse model of melanoma, Peinado et al. report that exosomes derived from highly metastatic tumor cells can influence bone marrow cells, resulting in increased recruitment of provasculogenic bone marrow progenitors to sites of metastasis, increased primary tumor growth and metastatic spread. Tumor-derived exosomes are emerging mediators of tumorigenesis. We explored the function of melanoma-derived exosomes in the formation of primary tumors and metastases in mice and human subjects. Exosomes from highly metastatic melanomas increased the metastatic behavior of primary tumors by permanently 'educating' bone marrow progenitors through the receptor tyrosine kinase MET. Melanoma-derived exosomes also induced vascular leakiness at pre-metastatic sites and reprogrammed bone marrow progenitors toward a pro-vasculogenic phenotype that was positive for c-Kit, the receptor tyrosine kinase Tie2 and Met. Reducing Met expression in exosomes diminished the pro-metastatic behavior of bone marrow cells. Notably, MET expression was elevated in circulating CD45−C-KITlow/+TIE2+ bone marrow progenitors from individuals with metastatic melanoma. RAB1A, RAB5B, RAB7 and RAB27A, regulators of membrane trafficking and exosome formation, were highly expressed in melanoma cells. Rab27A RNA interference decreased exosome production, preventing bone marrow education and reducing, tumor growth and metastasis. In addition, we identified an exosome-specific melanoma signature with prognostic and therapeutic potential comprised of TYRP2, VLA-4, HSP70, an HSP90 isoform and the MET oncoprotein. Our data show that exosome production, transfer and education of bone marrow cells supports tumor growth and metastasis, has prognostic value and offers promise for new therapeutic directions in the metastatic process.

Pancreatic ductal adenocarcinomas (PDACs) are highly metastatic with poor prognosis, mainly due to delayed detection. We hypothesized that intercellular communication is critical for metastatic progression. Here, we show that PDAC-derived exosomes induce liver pre-metastatic niche formation in naive mice and consequently increase liver metastatic burden. Uptake of PDAC-derived exosomes by Kupffer cells caused transforming growth factor β secretion and upregulation of fibronectin production by hepatic stellate cells. This fibrotic microenvironment enhanced recruitment of bone marrow-derived macrophages. We found that macrophage migration inhibitory factor (MIF) was highly expressed in PDAC-derived exosomes, and its blockade prevented liver pre-metastatic niche formation and metastasis. Compared with patients whose pancreatic tumours did not progress, MIF was markedly higher in exosomes from stage I PDAC patients who later developed liver metastasis. These findings suggest that exosomal MIF primes the liver for metastasis and may be a prognostic marker for the development of PDAC liver metastasis. Lyden and colleagues report that pancreatic cancer-derived exosomes induce a pre-metastatic niche in the liver by promoting TGFβ secretion from Kupffer cells, leading to fibronectin production in hepatic stellate cells and macrophage recruitment.

The heterogeneity of exosomal populations has hindered our understanding of their biogenesis, molecular composition, biodistribution and functions. By employing asymmetric flow field-flow fractionation (AF4), we identified two exosome subpopulations (large exosome vesicles, Exo-L, 90–120 nm; small exosome vesicles, Exo-S, 60–80 nm) and discovered an abundant population of non-membranous nanoparticles termed ‘exomeres’ (~35 nm). Exomere proteomic profiling revealed an enrichment in metabolic enzymes and hypoxia, microtubule and coagulation proteins as well as specific pathways, such as glycolysis and mTOR signalling. Exo-S and Exo-L contained proteins involved in endosomal function and secretion pathways, and mitotic spindle and IL-2/STAT5 signalling pathways, respectively. Exo-S, Exo-L and exomeres each had unique N-glycosylation, protein, lipid, DNA and RNA profiles and biophysical properties. These three nanoparticle subsets demonstrated diverse organ biodistribution patterns, suggesting distinct biological functions. This study demonstrates that AF4 can serve as an improved analytical tool for isolating extracellular vesicles and addressing the complexities of heterogeneous nanoparticle subpopulations. Lyden and colleagues use asymmetric flow field-flow fractionation to classify nanoparticles derived from cell lines and human samples, including previously uncharacterized large, Exo-L and small, Exo-S, exosome subsets.

Transcriptional repression mechanisms have emerged as one of the crucial processes for the downregulation of E-cadherin expression during development and tumour progression. Recently, several E-cadherin transcriptional repressors have been characterized (Snail, E12/E47, ZEB-1 and SIP-1) and shown to act through an interaction with proximal E-boxes of the E-cadherin promoter. We have analyzed the participation of another member of the Snail family, Slug, and observed that it also behaves as a repressor of E-cadherin expression. Stable expression of Slug in MDCK cells leads to the full repression of E-cadherin at transcriptional level and triggers a complete epithelial to mesenchymal transition. Slug-induced repression of E-cadherin is mediated by its binding to proximal E-boxes, particularly to the E-pal element of the mouse promoter. Detailed analysis of the binding affinity of different repressors to the E-pal element indicates that Slug binds with lower affinity than Snail and E47 proteins. These results, together with the known expression patterns of these factors in embryonic development and carcinoma cell lines, support the idea that the in vivo action of the different factors in E-cadherinrepression can be modulated by their relative concentrations as well as by specific cellular or tumour contexts.

In a significant fraction of breast cancer patients, distant metastases emerge after years or even decades of latency. How disseminated tumour cells (DTCs) are kept dormant, and what wakes them up, are fundamental problems in tumour biology. To address these questions, we used metastasis assays in mice and showed that dormant DTCs reside on microvasculature of lung, bone marrow and brain. We then engineered organotypic microvascular niches to determine whether endothelial cells directly influence breast cancer cell (BCC) growth. These models demonstrated that endothelial-derived thrombospondin-1 induces sustained BCC quiescence. This suppressive cue was lost in sprouting neovasculature; time-lapse analysis showed that sprouting vessels not only permit, but accelerate BCC outgrowth. We confirmed this surprising result in dormancy models and in zebrafish, and identified active TGF-β1 and periostin as tumour-promoting factors derived from endothelial tip cells. Our work reveals that stable microvasculature constitutes a dormant niche, whereas sprouting neovasculature sparks micrometastatic outgrowth. Bissell, Ghajar and colleagues use organotypic culture systems and in vivo mouse and zebrafish models to reveal the distinct effects of different microvascular niches on tumour cell dormancy. They report that although the stable microvasculature promotes cancer cell quiescence through the production of thrombospondin-1, cancer cells residing near neovascular tips are induced to grow through the action of TGF-β and periostin.

The transcription factor Snail has been described as a direct repressor of E-cadherin expression during development and carcinogenesis; however, the specific mechanisms involved in this process remain largely unknown. Here we show that mammalian Snail requires histone deacetylase (HDAC) activity to repress E-cadherin promoter and that treatment with trichostatin A (TSA) is sufficient to block the repressor effect of Snail. Moreover, overexpression of Snail is correlated with deacetylation of histones H3 and H4 at the E-cadherin promoter, and TSA treatment in Snail-expressing cells reverses the acetylation status of histones. Additionally, we demonstrate that Snail interacts in vivo with the E-cadherin promoter and recruits HDAC activity. Most importantly, we demonstrate an interaction between Snail, histone deacetylase 1 (HDAC1) and HDAC2, and the corepressor mSin3A. This interaction is dependent on the SNAG domain of Snail, indicating that the Snail transcription factor mediates the repression by recruitment of chromatin-modifying activities, forming a multimolecular complex to repress E-cadherin expression. Our results establish a direct causal relationship between Snail-dependent repression of E-cadherin and the modification of chromatin at its promoter.

The Snail transcription factor has been described recently as a strong repressor of E-cadherin in epithelial cell lines, where its stable expression leads to the loss of E-cadherin expression and induces epithelial-mesenchymal transitions and an invasive phenotype. The mechanisms regulating Snail expression in development and tumor progression are not yet known. We show here that transforming growth factor β-1 (TGFβ1) induces Snail expression in Madin-Darby canine kidney cells and triggers epithelial-mesenchymal transitions by a mechanism dependent on the MAPK signaling pathway. Furthermore, TGFβ1 induces the activity of Snail promoter, whereas fibroblast growth factor-2 has a milder effect but cooperates with TGFβ1 in the induction of Snail promoter. Interestingly, TGFβ1-mediated induction of Snail promoter is blocked by a dominant negative form of H-Ras (N17Ras), whereas oncogenic H-Ras (V12Ras) induces Snail promoter activity and synergistically cooperates with TGFβ1. The effects of TGFβ1 on Snail promoter are dependent of MEK1/2 activity but are apparently independent of Smad4 activity. In addition, H-Ras-mediated induction of Snail promoter, alone or in the presence of TGFβ1, depends on both MAPK and phosphatidylinositol 3-kinase activities. These data support that MAPK and phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathways are implicated in TGFβ1-mediated induction of Snail promoter, probably through Ras activation and its downstream effectors. The Snail transcription factor has been described recently as a strong repressor of E-cadherin in epithelial cell lines, where its stable expression leads to the loss of E-cadherin expression and induces epithelial-mesenchymal transitions and an invasive phenotype. The mechanisms regulating Snail expression in development and tumor progression are not yet known. We show here that transforming growth factor β-1 (TGFβ1) induces Snail expression in Madin-Darby canine kidney cells and triggers epithelial-mesenchymal transitions by a mechanism dependent on the MAPK signaling pathway. Furthermore, TGFβ1 induces the activity of Snail promoter, whereas fibroblast growth factor-2 has a milder effect but cooperates with TGFβ1 in the induction of Snail promoter. Interestingly, TGFβ1-mediated induction of Snail promoter is blocked by a dominant negative form of H-Ras (N17Ras), whereas oncogenic H-Ras (V12Ras) induces Snail promoter activity and synergistically cooperates with TGFβ1. The effects of TGFβ1 on Snail promoter are dependent of MEK1/2 activity but are apparently independent of Smad4 activity. In addition, H-Ras-mediated induction of Snail promoter, alone or in the presence of TGFβ1, depends on both MAPK and phosphatidylinositol 3-kinase activities. These data support that MAPK and phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathways are implicated in TGFβ1-mediated induction of Snail promoter, probably through Ras activation and its downstream effectors. The molecular mechanisms underlying local invasion and metastasis are still poorly understood, but evidence accumulated in the last years indicates the existence of common cellular mechanisms for the local invasive process that represent the first stage into the metastatic cascade of carcinomas (1Hanahan D. Weinberg R.A. Cell. 2000; 100: 57-70Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (22406) Google Scholar, 2Stetler-Stevenson W.G. Aznavoorian S. Liotta L.A. Annu. Rev. Cell Biol. 1993; 9: 541-573Crossref PubMed Scopus (1523) Google Scholar). Among those, loss of expression or function of the E-cadherin cell-cell adhesion molecule has emerged as an important event for local invasion of epithelial tumor cells, leading to the consideration of E-cadherin as an invasion-suppressor gene (3Berx G. Cleton-Jansen A.M. Nollet F. de Leeuw W.J. van de Vijver M. Cornelisse C. van Roy F. EMBO J. 1995; 14: 6107-6115Crossref PubMed Scopus (658) Google Scholar, 4Birchmeier W. Behrens J. Biochim. Biophys Acta. 1994; 1198: 11-26Crossref PubMed Scopus (933) Google Scholar, 5Christofori G. Semb H. Trends Biochem. Sci. 1999; 24: 73-76Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (650) Google Scholar). The process of invasion is frequently associated with the loss of other epithelial markers and the acquisition of mesenchymal markers and a migratory and motility behavior, collectively known as epithelial-mesenchymal transitions (EMTs) 1The abbreviations used are: EMTs, epithelial-mesenchymal transitions; AP, activator protein; ERK, extracellular signal-regulated kinase; FGF, fibroblast growth factor; MAPK, mitogen-activated protein kinase; MDCK, Madin-Darby canine kidney; MEK, MAPK/ERK kinase; PI3K, phosphatidylinositol 3-kinase; RT, reverse transcription; TGFβ, transforming growth factor β; FBS, fetal bovine serum. (see Ref. 6Thiery J.P. Nat. Rev. Cancer. 2002; 2: 442-454Crossref PubMed Scopus (5489) Google Scholar for a recent review). EMTs also occur during normal embryonic development in a strict spatio-temporal control, and they are required at specific stages, such as during gastrulation, formation of the neural crest cells, and other morphogenetic processes (6Thiery J.P. Nat. Rev. Cancer. 2002; 2: 442-454Crossref PubMed Scopus (5489) Google Scholar, 7Hay E.D. Acta Anat. 1995; 154: 8-20Crossref PubMed Scopus (1244) Google Scholar, 8Sun D. Baur S. Hay E.D. Dev. Biol. 2000; 228: 337-349Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar). These developmental EMTs are always accompanied by the loss of functional E-cadherin-mediated cell-cell adhesion (9Huber O. Bierkamp C. Kemler R. Curr. Opin. Cell Biol. 1996; 8: 685-691Crossref PubMed Scopus (308) Google Scholar, 10Takeichi M. Curr. Opin. Cell Biol. 1995; 7: 619-627Crossref PubMed Scopus (1258) Google Scholar). The molecular mechanisms underlying down-regulation of E-cadherin during EMTs and tumor progression are starting to be uncovered. Genetic alterations of the E-cadherin loci have been found in a scarce number of tumors, particularly in lobular breast carcinomas and diffuse gastric carcinomas (3Berx G. Cleton-Jansen A.M. Nollet F. de Leeuw W.J. van de Vijver M. Cornelisse C. van Roy F. EMBO J. 1995; 14: 6107-6115Crossref PubMed Scopus (658) Google Scholar, 11Becker K.F. Atkinson M.J. Reich U. Becker I. Nekarda H. Siewert J.R. Hofler H. Cancer Res. 1994; 54: 3845-3852PubMed Google Scholar, 12Guilford P. Hopkins J. Harraway J. McLeod M. McLeod N. Harawira P. Taite H. Scoular R. Miller A. Reeve A.E. Nature. 1998; 392: 402-405Crossref PubMed Scopus (1379) Google Scholar), whereas the majority of carcinomas with down-regulated E-cadherin maintain an intact E-cadherin locus. Hypermethylation of the E-cadherin promoter and transcriptional alterations have emerged as the main mechanisms responsible for E-cadherin down-regulation in most carcinomas (5Christofori G. Semb H. Trends Biochem. Sci. 1999; 24: 73-76Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (650) Google Scholar, 13Cheng C.W. Wu P.E. Yu J.C. Huang C.S. Yue C.T. Wu C.W. Shen C.Y. Oncogene. 2001; 20: 3814-3823Crossref PubMed Scopus (196) Google Scholar). Several transcriptional repressors of E-cadherin have been isolated recently, including the zinc finger factors Snail (14Cano A. Pérez-Moreno M.A. Rodrigo I. Locascio A. Blanco M.J. del Barrio M.G. Portillo F. Nieto M.A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 76-83Crossref PubMed Scopus (2931) Google Scholar, 15Batlle E. Sancho E. Franci C. Dominguez D. Monfar M. Baulida J. Garcia De Herreros A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 84-89Crossref PubMed Scopus (2172) Google Scholar) and Slug (16Hajra K.M. Chen D.Y. Fearon E.R. Cancer Res. 2002; 62: 1613-1618PubMed Google Scholar, 17Bolós V Peinado H. Pérez M oreno M.A. Fraga M.F. Esteller M. Cano A. J. Cell Sci. 2003; 116: 499-511Crossref PubMed Scopus (931) Google Scholar), the two-handed zinc factors ZEB-1 and SIP-1 (18Comijn J. Berx G. Vermassen P. Verschueren K. van Grunsven L. Bruyneel E. Mareel M. Huylebroeck D. van Roy F. Mol. Cell. 2001; 7: 1267-1278Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1155) Google Scholar, 19Grooteclaes M.L. Frisch S.M. Oncogene. 2000; 19: 3823-3828Crossref PubMed Scopus (268) Google Scholar), and the bHLH factor E12/E47 (20Pérez-Moreno M.A. Locascio A. Rodrigo I. Dhondt G. Portillo F. Nieto M.A. Cano A. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27424-27431Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (375) Google Scholar). Snail family factors are in fact involved in EMTs when overexpressed in epithelial cell lines (14Cano A. Pérez-Moreno M.A. Rodrigo I. Locascio A. Blanco M.J. del Barrio M.G. Portillo F. Nieto M.A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 76-83Crossref PubMed Scopus (2931) Google Scholar, 15Batlle E. Sancho E. Franci C. Dominguez D. Monfar M. Baulida J. Garcia De Herreros A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 84-89Crossref PubMed Scopus (2172) Google Scholar, 17Bolós V Peinado H. Pérez M oreno M.A. Fraga M.F. Esteller M. Cano A. J. Cell Sci. 2003; 116: 499-511Crossref PubMed Scopus (931) Google Scholar), as well as in embryonic development (reviewed in Ref. 21Nieto M.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002; 3: 155-166Crossref PubMed Scopus (1421) Google Scholar), and are proposed to act as inducers of the invasion process (14Cano A. Pérez-Moreno M.A. Rodrigo I. Locascio A. Blanco M.J. del Barrio M.G. Portillo F. Nieto M.A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 76-83Crossref PubMed Scopus (2931) Google Scholar, 22Blanco M.J. Moreno-Bueno G. Sarrio D. Locascio A. Cano A. Palacios J. Nieto M.A. Oncogene. 2002; 21: 3241-3246Crossref PubMed Scopus (487) Google Scholar). Generation of Snail knockout mice has further established the role of this factor in EMT and as the E-cadherin gene repressor. The null Snail embryos die at gastrulation as they fail to undergo a complete EMT process, forming an altered mesodermal layer that maintains the expression of E-cadherin (23Carver E.A. Jiang R. Lan Y. Oram K.F. Gridley T. Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 8184-8188Crossref PubMed Scopus (513) Google Scholar). Nevertheless, the mechanisms that regulate the expression of Snail factors are still poorly understood (6Thiery J.P. Nat. Rev. Cancer. 2002; 2: 442-454Crossref PubMed Scopus (5489) Google Scholar, 21Nieto M.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002; 3: 155-166Crossref PubMed Scopus (1421) Google Scholar). Different growth factors and cytokines have also been implicated in the process of EMTs in both epithelial cell systems and in embryonic development. Studies on development have indicated the participation of several members of the transforming growth factor (TGFβ)/bone morphogenetic family of growth factors in specific EMT processes in different species (24Liem Jr., K.F. Tremml G. Roelink H. Jessell T.M. Cell. 1995; 82: 969-979Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (916) Google Scholar, 25Romano L.A. Runyan R.B. Dev. Biol. 2000; 223: 91-102Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar), whereas fibroblast growth factor (FGF) signaling has been reported recently (26Ciruna B. Rossant J. Dev. Cell. 2001; 1: 37-49Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (513) Google Scholar) as a determinant for mesoderm cell fate specification in the mouse embryo. Several studies have also indicated that a multiple cross-talk among TGFβ/bone morphogenetics, FGF, and Wnt signals could be required for some EMTs in development (26Ciruna B. Rossant J. Dev. Cell. 2001; 1: 37-49Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (513) Google Scholar, 27Dorsky R.I. Moon R.T. Raible D.W. Nature. 1998; 396: 370-373Crossref PubMed Scopus (416) Google Scholar, 28LaBonne C. Bronner-Fraser M. Development. 1998; 125: 2403-2414Crossref PubMed Google Scholar). In epithelial cell systems, several growth factors have been widely studied and reported to induce a scattering phenotype or a complete EMT depending on the specific cell system analyzed (reviewed in Refs. 6Thiery J.P. Nat. Rev. Cancer. 2002; 2: 442-454Crossref PubMed Scopus (5489) Google Scholar and 29Boyer B. Valles A.M. Edme N. Biochem. Pharmacol. 2000; 60: 1091-1099Crossref PubMed Scopus (383) Google Scholar). Among them, TGFβ has been identified as an important molecular player of EMT both in vitro and in vivo (30Caulín C. Scholl F.G. Frontelo P. Gamallo C. Quintanilla M. Cell Growth Differ. 1995; 6: 1027-1035PubMed Google Scholar, 31Cui W. Fowlis D.J. Bryson S. Duffie E. Ireland H. Balmain A. Akhurst R.J. Cell. 1996; 86: 531-542Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (539) Google Scholar, 32Miettinen P.J. Ebner R. Lopez A.R. Derynck R. J. Cell Biol. 1994; 127: 2021-2036Crossref PubMed Scopus (796) Google Scholar, 33Oft M. Peli J. Rudaz C. Schwarz H. Beug H. Reichmann E. Genes Dev. 1996; 10: 2462-2477Crossref PubMed Scopus (565) Google Scholar, 34Portella G. Cumming S.A. Liddell J. Cui W. Ireland H. Akhurst R.J. Balmain A. Cell Growth Differ. 1998; 9: 393-404PubMed Google Scholar). In some cell systems, a synergistic cooperation between H-Ras activation and TGFβ signaling appears to be required for induction of a complete EMT (33Oft M. Peli J. Rudaz C. Schwarz H. Beug H. Reichmann E. Genes Dev. 1996; 10: 2462-2477Crossref PubMed Scopus (565) Google Scholar, 35Gotzmann J. Huber H. Thallinger C. Wolschek M. Jansen B. Schulte-Hermann R. Beug H. Mikulits W. J. Cell Sci. 2002; 115: 1189-1202PubMed Google Scholar, 36Janda E. Lehmann K. Killisch I. Jechlinger M. Herzig M. Downward J. Beug H. Grunert S. J. Cell Biol. 2002; 156: 299-313Crossref PubMed Scopus (613) Google Scholar). Recently, TGFβ has been reported to induce the expression of Snail in fetal and in immortalized murine hepatocytes and in human mesothelial cells (37Spagnoli F.M. Cicchini C. Tripodi M. Weiss M.C. J. Cell Sci. 2000; 113: 3639-3647PubMed Google Scholar, 38Valdes F. Alvarez A.M. Locascio A. Vega S. Herrera B. Fernandez M. Benito M. Nieto M.A. Fabregat I. Mol. Cancer Res. 2002; 1: 68-78PubMed Google Scholar, 39Yanez-Mo M. Lara-Pezzi E. Selgas R. Ramirez-Huesca M. Dominguez-Jimenez C. Jimenez-Heffernan J.A. Aguilera A. Sanchez-Tomero J.A. Bajo M.A. Alvarez V. Castro M.A. del Peso G. Cirujeda A. Gamallo C. Sanchez-Madrid F. Lopez-Cabrera M. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 403-413Crossref PubMed Scopus (623) Google Scholar), but whether this is a direct or indirect effect has not yet been established. The participation of specific signaling pathways activated by TGFβ and/or H-Ras activation in EMTs has been analyzed previously with somewhat contradictory results as regard to the specific implication of Smad, mitogen-activated protein kinase (MAPK) and/or phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathways (36Janda E. Lehmann K. Killisch I. Jechlinger M. Herzig M. Downward J. Beug H. Grunert S. J. Cell Biol. 2002; 156: 299-313Crossref PubMed Scopus (613) Google Scholar, 40Bakin A.V. Tomlinson A.K. Bhowmick N.A. Moses H.L. Arteaga C.L. J. Biol. Chem. 2000; 275: 36803-36810Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (830) Google Scholar, 41Chen Y. Lu Q. Schneeberger E.E. Goodenough D.A. Mol. Biol. Cell. 2000; 11: 849-862Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 42Montesano R. Soriano J.V. Hosseini G. Pepper M.S. Schramek H. Cell Growth Differ. 1999; 10: 317-332PubMed Google Scholar, 43Potempa S. Ridley A.J. Mol. Biol. Cell. 1998; 9: 2185-2200Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar). The issue has been unraveled recently (36Janda E. Lehmann K. Killisch I. Jechlinger M. Herzig M. Downward J. Beug H. Grunert S. J. Cell Biol. 2002; 156: 299-313Crossref PubMed Scopus (613) Google Scholar) in the EpRas model with the implication of MAPK in TGFβ-induced EMT, tumorigenesis, and metastasis, whereas PI3K is involved in cell scattering and resistance to TGF-β induced apoptosis. It remains to be established, however, if the same situation applies to other systems and, more importantly, the identification of the target genes involved in the specific growth factor signaling leading to EMTs. We have used the prototypic epithelial MDCK cells to further analyze the process of EMT induced by TGFβ and FGF. We have previously used this cell system to show that Snail overexpression leads to the full repression of E-cadherin expression and induction of a complete EMT (14Cano A. Pérez-Moreno M.A. Rodrigo I. Locascio A. Blanco M.J. del Barrio M.G. Portillo F. Nieto M.A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 76-83Crossref PubMed Scopus (2931) Google Scholar). In the present work we have investigated the ability of TGFβ1 and FGF2 to induce an EMT in MDCK cells and ask whether Snail is a target gene of this process. We present evidence that TGFβ1 treatment induces an EMT process linked to Snail induction in MDCK cells. Analysis of the mouse Snail promoter indicates that it is directly induced by TGFβ1 and that FGF2 and activated H-Ras cooperate with TGFβ1 in induction of the Snail promoter. Our results also indicate that the MAPK and PI3K pathways are involved in the TGFβ1- and H-Ras-mediated induction of Snail promoter. These results strongly support that Snail is a direct target of TGFβ1 and oncogenic H-Ras and open the way for future studies on the molecular mechanisms and targets of EMTs and the invasion process. Cell Culture and Treatments—MDCK-II cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium and MCA3D and PDV cells in Ham's F-12 medium, in the presence of 10% FBS, 10 mm glutamine (Invitrogen), and 100 μg/ml ampicillin, 32 μg/ml gentamicin (Sigma). Cells were grown at 37 °C in a humidified CO2 atmosphere. All the transfections and treatments were done in FBS-free culture medium. For the indicated treatments, 10 μg/ml stocks of recombinant TGFβ1 (BioNova Corp.) and 100 μg/ml of FGF2 (Peprotech) were prepared according to manufacturer's instructions and added to the indicated concentrations. The PI3K and MEK1/2 inhibitors, LY294002 and PD98059 (Calbiochem), respectively, were kept as 30–10 mm stocks in Me2SO, which was used as vehicle control in all the inhibitor treatments. RT-PCR Analyses—Total RNA was isolated from the different cell lines, and RT-PCR analyses were carried out as described previously (14Cano A. Pérez-Moreno M.A. Rodrigo I. Locascio A. Blanco M.J. del Barrio M.G. Portillo F. Nieto M.A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 76-83Crossref PubMed Scopus (2931) Google Scholar, 17Bolós V Peinado H. Pérez M oreno M.A. Fraga M.F. Esteller M. Cano A. J. Cell Sci. 2003; 116: 499-511Crossref PubMed Scopus (931) Google Scholar, 20Pérez-Moreno M.A. Locascio A. Rodrigo I. Dhondt G. Portillo F. Nieto M.A. Cano A. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27424-27431Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (375) Google Scholar). Canine PCR products were obtained after 30–35 cycles of amplification with an annealing temperature of 60–65 °C. Primer sequences were as follows: for canine E-cadherin (sequence kindly provided by Y. Chen, Harvard Medical School), forward: 5′-GGAATCCTTGGAGGGATCCTC-3′; reverse: 5′-GTCGTCCTCGC-CACCGCCGTACAT-3′ (amplifies a fragment of 560 bp); for canine Snail, forward: 5′-CCCAAGCCCAGCCGATGAG-3′; reverse: 5′-CTTGGCCACGGAGAGCCC-3′ (amplifies a fragment of 200 bp); and for canine glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase, forward: 5′-TGAAGGTCGGT-GTGAACGGATTTGGC-3′; reverse: 5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′ (amplifies a fragment of 900 bp). 3TP-Lux, E-cadherin, and Snail Promoter Analyses—For 3TP-Lux assays a reporter construct containing the 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and TGFβ response elements fused to the Luciferase reporter gene (44Lagna G. Hata A. Hemmati-Brivanlou A. Massague J. Nature. 1996; 383: 832-836Crossref PubMed Scopus (810) Google Scholar) was used. The generation of mouse E-cadherin promoter constructs containing -178/+92 sequences in its wild-type or mutant Epal fused to Luciferase has been reported previously (17Bolós V Peinado H. Pérez M oreno M.A. Fraga M.F. Esteller M. Cano A. J. Cell Sci. 2003; 116: 499-511Crossref PubMed Scopus (931) Google Scholar). Generation of full-length mouse Snail promoter construct (-900 bp) has also been described recently (17Bolós V Peinado H. Pérez M oreno M.A. Fraga M.F. Esteller M. Cano A. J. Cell Sci. 2003; 116: 499-511Crossref PubMed Scopus (931) Google Scholar). Deletion constructs of the Snail promoter mutants were obtained by PCR amplification from the full-length -900 bp promoter using appropriate primers containing BamHI and KpnI restriction sites and the corresponding PCR products cloned into the same restriction sites in the pXP1-Luciferase vector. To determine the activity of 3TP-Lux and the Snail promoter 2 × 105 cells grown in 24-well plates were transiently transfected with 200 to 500 ng of the indicated reporter constructs and 20 ng of TK-Renilla construct (Promega) as a control of transfection efficiency. Luciferase and renilla activities were measured using a dual-luciferase reporter assay kit (Promega), and after normalization the results were referred to the wild-type promoter activity detected in mock-transfected cells. Results represent the mean ± S.D. of at least two independent experiments performed in duplicate samples. For the cotransfection experiments 500 ng of the following plasmids were used: pSmad4 DN (1–514) in pCMV5 vector (provided by J. Massagué, Sloan-Kettering Memorial Cancer Center) (44Lagna G. Hata A. Hemmati-Brivanlou A. Massague J. Nature. 1996; 383: 832-836Crossref PubMed Scopus (810) Google Scholar); pLXSNHRasV12, pLXSNHRasN17, and the different mutants of HRasV12 (pLXSNHRasV12S35, pLXSNHRasV12C40, and pHras-LXSNRasV12G37) in the pLXSN vector (a gift of P. Rodriguez-Viciana, University of California Cancer Research Institute) (45Rodriguez-Viciana P. Warne P.H. Khwaja A. Marte B.M. Pappin D. Das P. Waterfield M.D. Ridley A. Downward J. Cell. 1997; 89: 457-467Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (960) Google Scholar); β-catenin S33Y (provided by A. Ben-Ze'ev, Weizmann Institute) and Lef-1 (provided by H. Clevers, Utrecht University Hospital) cloned in pcDNA3. The corresponding empty vectors, pLXSN, pCMV5, or pcDNA3 were used in control transfections and for normalization of the total amount of DNA. Immunofluorescence and Western Blot Analyses—For immunofluorescence staining cells grown on coverslips were fixed in methanol (-20 °C, 30 s) and stained for E-cadherin, vimentin, cytokeratin-8, and fibronectin as described previously (14Cano A. Pérez-Moreno M.A. Rodrigo I. Locascio A. Blanco M.J. del Barrio M.G. Portillo F. Nieto M.A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 76-83Crossref PubMed Scopus (2931) Google Scholar, 17Bolós V Peinado H. Pérez M oreno M.A. Fraga M.F. Esteller M. Cano A. J. Cell Sci. 2003; 116: 499-511Crossref PubMed Scopus (931) Google Scholar, 20Pérez-Moreno M.A. Locascio A. Rodrigo I. Dhondt G. Portillo F. Nieto M.A. Cano A. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27424-27431Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (375) Google Scholar). For F-actin stain, cells were fixed in 3.7% formaldehyde, 0.5% Triton X-100 for 30 min at room temperature, stained with tetramethyl rhodamine isothiocyanate-conjugated phalloidin (Sigma) and washed four times in phosphate-buffered saline. The cells were mounted on Mowiol, and the preparations were visualized using a Leica confocal TCS SP2 microscope. For Western blot, whole cell extracts of control and treated cells were obtained in radioimmune precipitation assay buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 150 mm NaCl, 1% Nonidet P-40, 5% deoxycholate, 0.1% SDS) and analyzed for the indicated molecules by Western blot and enhanced chemiluminescence detection as described previously (14Cano A. Pérez-Moreno M.A. Rodrigo I. Locascio A. Blanco M.J. del Barrio M.G. Portillo F. Nieto M.A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 76-83Crossref PubMed Scopus (2931) Google Scholar, 17Bolós V Peinado H. Pérez M oreno M.A. Fraga M.F. Esteller M. Cano A. J. Cell Sci. 2003; 116: 499-511Crossref PubMed Scopus (931) Google Scholar, 20Pérez-Moreno M.A. Locascio A. Rodrigo I. Dhondt G. Portillo F. Nieto M.A. Cano A. J. Biol. Chem. 2001; 276: 27424-27431Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (375) Google Scholar). Primary anti-bodies included rat monoclonal anti-E-cadherin ECCD-2 (1:100) (provided by M. Takeichi, Kyoto University), mouse monoclonal antivimentin (1:200) (Dako), mouse monoclonal anti-cytokeratin 8 (1:200) (Progen), rabbit polyclonal anti-fibronectin (1:100), and mouse monoclonal anti-α-tubulin (1:1000) (Sigma). For cell signaling analysis, Western blots were carried out on cell extracts obtained by lysis in Buffer A (20 mm Hepes, pH 7.5, 10 mm EGTA, 40 mm β-glycerophosphate, 2.5 mm MgCl2, 1% Nonidet P-40, 1 mm dithiothreitol), containing the appropriate protease and phosphatase inhibitors, during 30 min. at 4 °C. Primary antisera included goat anti-AKT (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), rabbit anti-phospho (Ser-473)-AKT (1:500), rabbit anti-ERK1/2 and anti-phospho (Thr-202/Tyr-204)-ERK1/2 (1:1000) (Cell Signaling Technology), and rabbit anti-Smad2/3 and rabbit anti-phospho (Ser-465/Ser-467)-Smad2/3 (1:500) (Upstate Biotechnology). Secondary antibodies were BODIPY-conjugated goat anti-rat, anti-mouse and anti-rabbit IgG (Molecular Probes), and horseradish peroxidase-conjugated sheep anti-mouse (1:1000) (Amersham Biosciences), donkey anti-goat (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), goat anti-rat (1:10,000) (Pierce), and goat anti-rabbit (1:4000) (Nordic) IgG. Cell Proliferation Assays—The indicated number of cells (2.5 × 105 or 5 × 105) were seeded in triplicate samples in 92 plates and grown in complete medium for 3 h. After washing in phosphate-buffered saline, TGFβ1 (10 ng/ml) in FBS-free medium was added, and the cells were grown for an additional 24 h. [3H]Thymidine was added during the last 5 h of treatment. The cells were collected using a cell harvester device, and [3H]thymidine incorporation was determined in a scintillation counter. The values, representing the mean ± S.D., were normalized to those obtained in control untreated cells. Migration Assays—The migratory/motility behavior of MDCK cells was analyzed in in vitro wound healing assays as described previously (14Cano A. Pérez-Moreno M.A. Rodrigo I. Locascio A. Blanco M.J. del Barrio M.G. Portillo F. Nieto M.A. Nat. Cell Biol. 2000; 2: 76-83Crossref PubMed Scopus (2931) Google Scholar, 17Bolós V Peinado H. Pérez M oreno M.A. Fraga M.F. Esteller M. Cano A. J. Cell Sci. 2003; 116: 499-511Crossref PubMed Scopus (931) Google Scholar). Monolayers of confluent cultures were lightly scratched with a Gilson pipette tip and, after washing to remove detached cells, treated with TGFβ1 (10 ng/ml) and/or PD98059 (10 μm), as indicated. Cultures were observed at timely intervals for up to 36 h post-incision. TGFβ1 Induces Cell Scattering and Increased Motility in MDCK Cells Dependent on MEK1/2 Activity—Some previous studies have related the TGFβ/bone morphogenetic signaling pathway to the regulation of EMT both during embryonic development (24Liem Jr., K.F. Tremml G. Roelink H. Jessell T.M. Cell. 1995; 82: 969-979Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (916) Google Scholar, 25Romano L.A. Runyan R.B. Dev. Biol. 2000; 223: 91-102Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar) and in some epithelial cell lines (30Caulín C. Scholl F.G. Frontelo P. Gamallo C. Quintanilla M. Cell Growth Differ. 1995; 6: 1027-1035PubMed Google Scholar, 32Miettinen P.J. Ebner R. Lopez A.R. Derynck R. J. Cell Biol. 1994; 127: 2021-2036Crossref PubMed Scopus (796) Google Scholar, 33Oft M. Peli J. Rudaz C. Schwarz H. Beug H. Reichmann E. Genes Dev. 1996; 10: 2462-2477Crossref PubMed Scopus (565) Google Scholar, 37Spagnoli F.M. Cicchini C. Tripodi M. Weiss M.C. J. Cell Sci. 2000; 113: 3639-3647PubMed Google Scholar), whereas others have potentially implicated a similar function for FGFs (46Migdal M. Soker S. Yarden Y. Neufeld G. J. Cell. Physiol. 1995; 162: 266-276Crossref PubMed Scopus (10) Google Scholar, 47Strutz F. Zeisberg M. Ziyadeh F.N. Yang C.Q. Kalluri R. Muller G.A. Neilson E.G. Kidney Int. 2002; 61: 1714-1728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (377) Google Scholar, 48Valles A.M. Boyer B. Badet J. Tucker G.C. Barritault D. Thiery J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 1124-1128Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar). To get further insights into the regulation of EMT by both kinds of growth factors, we choose the prototypic epithelial MDCK cell line. Twenty-four h of treatment with TGFβ1 (10 ng/ml) (Fig. 1A, b) or a combination of TGFβ1 (10 ng/ml) and FGF2 (100 ng/ml) (Fig. 1A, c) induced a dramatic change of the cellular phenotype; MDCK cells became dissociated with reduced cell-cell contacts and acquired a more spindle phenotype. Lower concentrations of TGFβ1 (1–5 ng) induced a milder effect, and treatment with FGF2 alone did not affect the phenotype of MDCK cells (data not shown). The phenotypic changes induced by TGFβ1 were also associated to increased cell motility, as ascertained by in vitro wound healing assays (Fig. 1B). Eight h after incision of the wound, MDCK cells growing in the presence of TGFβ1 started to colonize the wound surface, whereas control untreated cells hardly started to migrate (data not shown). The differences in cell motility were evident 24 h after incision when TGFβ1-treated cells colonized about 70–80% of the wound surface in a random fashion (Fig. 1B, g), in contrast to untreated cells that had only colonized 20–30% of the wound surface by unidirectional migration (Fig. 1B, e). The increased motility induced by TGFβ1 treatment is not because of increased cell proliferation. Analysis of [3H]thymidine incorporation showed that MDCK cells treated with TGFβ1 exhibited an 80% reduction of their proliferation potential, as compared with control untreated cells (Fig. 2A). After 3–4 days of TGFβ1 treatment MDCK cells started to show signs of apoptosis, and most cells died after 7 days of treatment (data not shown). The sensitivity of MDCK cells to TGFβ1 was also evidenced by the quick induction of the responsive 3TP-Lux promoter in the presence of the growth factor (Fig. 2B).Fig. 2TGFβ1 treatment induces proliferation arrest and transcriptional responses in MDCK cells.A, [3H]thymidine incorporation

Artilce18 August 2005free access A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme in Snail regulation and tumor progression Héctor Peinado Héctor Peinado Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author Maria del Carmen Iglesias-de la Cruz Maria del Carmen Iglesias-de la Cruz Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author David Olmeda David Olmeda Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author Katalin Csiszar Katalin Csiszar Cardiovascular Research Center, John A Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI, USA Search for more papers by this author Keith SK Fong Keith SK Fong Cardiovascular Research Center, John A Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI, USA Search for more papers by this author Sonia Vega Sonia Vega Instituto Cajal, Avenida Doctor Arce, Madrid, SpainPresent address: Instituto de Neurociencias, Apartado de Correos, 18, 03550 San Juan, Alicante, Spain Search for more papers by this author Maria Angela Nieto Maria Angela Nieto Instituto Cajal, Avenida Doctor Arce, Madrid, SpainPresent address: Instituto de Neurociencias, Apartado de Correos, 18, 03550 San Juan, Alicante, Spain Search for more papers by this author Amparo Cano Corresponding Author Amparo Cano Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author Francisco Portillo Corresponding Author Francisco Portillo Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author Héctor Peinado Héctor Peinado Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author Maria del Carmen Iglesias-de la Cruz Maria del Carmen Iglesias-de la Cruz Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author David Olmeda David Olmeda Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author Katalin Csiszar Katalin Csiszar Cardiovascular Research Center, John A Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI, USA Search for more papers by this author Keith SK Fong Keith SK Fong Cardiovascular Research Center, John A Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI, USA Search for more papers by this author Sonia Vega Sonia Vega Instituto Cajal, Avenida Doctor Arce, Madrid, SpainPresent address: Instituto de Neurociencias, Apartado de Correos, 18, 03550 San Juan, Alicante, Spain Search for more papers by this author Maria Angela Nieto Maria Angela Nieto Instituto Cajal, Avenida Doctor Arce, Madrid, SpainPresent address: Instituto de Neurociencias, Apartado de Correos, 18, 03550 San Juan, Alicante, Spain Search for more papers by this author Amparo Cano Corresponding Author Amparo Cano Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author Francisco Portillo Corresponding Author Francisco Portillo Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain Search for more papers by this author Author Information Héctor Peinado1,‡, Maria del Carmen Iglesias-de la Cruz1,‡, David Olmeda1, Katalin Csiszar2, Keith SK Fong2, Sonia Vega3, Maria Angela Nieto3, Amparo Cano 1 and Francisco Portillo 1 1Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid, Arturo Duperier, Madrid, Spain 2Cardiovascular Research Center, John A Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI, USA 3Instituto Cajal, Avenida Doctor Arce, Madrid, Spain ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding authors: Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’, CSIC-UAM, Arturo Duperier 4, 28029 Madrid, Spain. Tel.: +34 91 585 4411; Fax: +34 91 585 4401; E-mail: [email protected] or Tel.: +34 91 585 4457; Fax: +34 91 585 4401; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2005)24:3446-3458https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600781 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The transcription factor Snail controls epithelial–mesenchymal transitions (EMT) by repressing E-cadherin expression and other epithelial genes. However, the mechanisms involved in the regulation of Snail function are not fully understood. Here we show that lysyl-oxidase-like 2 and 3 (LOXL2 and LOXL3), two members of the lysyl-oxidase gene family, interact and cooperate with Snail to downregulate E-cadherin expression. Snail's lysine residues 98 and 137 are essential for Snail stability, functional cooperation with LOXL2/3 and induction of EMT. Overexpression of LOXL2 or LOXL3 in epithelial cells induces an EMT process, supporting their implication in tumor progression. The biological importance of LOXL2 is further supported by RNA interference of LOXL2 in Snail-expressing metastatic carcinoma cells, which led to a strong decrease of tumor growth associated to increased apoptosis and reduced expression of mesenchymal and invasive/angiogenic markers. Taken together, these results establish a direct link between LOXL2 and Snail in carcinoma progression. Introduction Epithelial tumors are thought to metastasize by initially invading the adjacent tissues, a process involving the loss of their cell–cell adhesions and the acquisition of migratory capabilities. These processes include phenotypical changes associated with epithelial–mesenchymal transitions (EMT), similar to those that take place during certain steps of embryonic development (Thiery, 2002). The invasive and metastatic phenotype is associated with downregulation of E-cadherin expression (Birchmeier and Behrens, 1994). Several mechanisms have been implicated in the regulation of E-cadherin expression during tumor progression, including genetic, epigenetic and transcriptional changes (Christofori and Semb, 1999; Peinado et al, 2004c). Snail transcription factor has been described as a direct repressor of E-cadherin expression in epithelial cells; the expression of Snail induces a full EMT and increases migration/invasion in different physiological and pathological situations (Batlle et al, 2000; Cano et al, 2000; Peinado et al, 2004b). Moreover, Snail expression has been detected in different invasive carcinoma and melanoma cell lines and, importantly, in invasive regions of squamous cell carcinomas and dedifferentiated ductal breast carcinomas and hepatocarcinomas (reviewed in Nieto, 2002; Peinado et al, 2004c). Recently, we have described the recruitment of the mSin3A corepressor complex with histone deacetylases (HDACs) by Snail, through the Snail and Gfi (SNAG) domain, to repress E-cadherin expression (Peinado et al, 2004a). In order to identify additional proteins that might interact with Snail to regulate E-cadherin expression, we carried out a yeast two-hybrid screen. Using Snail as bait, we found members of the lysyl oxidase (LOX) gene family to be potential interacting partners. Five LOX family genes have been identified so far in mammalian genomes encoding the prototypic LOX and four different LOX-like proteins (LOXL1, LOXL2, LOXL3 and LOXL4) (Kagan and Li, 2003; Molnar et al, 2003). LOX and LOX-like proteins are copper-containing enzymes that catalyze the oxidative deamination of the ε-amino group in certain peptidyl lysine residues promoting covalent protein crosslinkages (Kagan and Li, 2003; Molnar et al, 2003). All members of the LOX family show a highly conserved C-terminus region that contains the catalytic domain. The N-terminus of the LOX isoforms is less conserved among the different members and it is thought to determine the individual role and tissue distribution of each isoenzyme (Maki et al, 2001). The prototypic LOX plays a key role in the biogenesis of the connective tissue catalyzing crosslinkage formation in collagen and elastin components (Kagan and Li, 2003) and, recently, it has been shown that LOXL1 is required for proper elastic fiber homeostasis (Liu et al, 2004). The individual function of the remaining members of the family remains unclear, although recent evidences suggest the involvement of LOX, LOXL2 or LOXL4 in breast and head and neck squamous cell carcinoma progression (Kirschmann et al, 2002; Akiri et al, 2003; Holtmeier et al, 2003). In the present report, we show that LOXL2 and LOXL3 collaborate in vivo with Snail to repress E-cadherin transcription. Snail–LOXL2/3 physical interaction depends on the SNAG domain and Snail's lysine residues K98 and K137 are critical for Snail stability and functional cooperation with LOXL2/3. We also present evidence for a role of LOXL2 in tumor growth and progression. Results LOXL2 and LOXL3 interact with Snail in vivo To identify new proteins involved in Snail functionality, we performed a yeast two-hybrid screen. Using the N-terminus part of Snail (amino acids 1–150; Figure 1A) as bait, we identified the catalytic domain of LOX and LOXL1 enzymes as positive clones in the screen (Figure 1B). Since the C-terminus is a region of high conservation among all LOX family members, one or more of the LOX isoforms could be potential Snail interacting partner(s). Thus, we analyzed by reverse transcriptase–polymerase chain reaction (RT–PCR) the expression of the endogenous LOX gene family in a panel of both mouse epidermal keratinocyte (MCA3D, CarB and HaCa4) (Figure 2A) and human melanoma and carcinoma cell lines (MCF7, MDA-MB231 MDA-MB435 and A375P) (Figure 2B). The analysis included from poorly invasive/nonmetastatic cell lines with normal levels of E-cadherin expression and undetectable levels of Snail transcripts (MCA3D and MCF7) to cell lines that show high levels of Snail expression, E-cadherin loss and a highly invasive/metastatic phenotype (CarB, HaCa4, MDA-MB231, MDA-MB435 and A375P) (Cano et al, 2000). We detected expression of LOXL2, LOXL3 and/or LOXL4 in cell lines that were highly invasive and metastatic but not of LOX and LOXL1 mRNAs (Figure 2A and B). Interestingly, we observed a direct correlation between the expression of at least one of the LOXL2, LOXL3 and LOXL4 genes, and the presence of Snail and the loss of E-cadherin transcripts. This result was further confirmed for LOXL2 and LOXL3 proteins by immunoblotting analysis using specific antibodies (Figure 2C and D). These results led us to pursue LOXL2, LOXL3 or LOXL4 as potential Snail's partners for collaborating in EMT. Figure 1.Snail interacts with LOX and LOXL1 in the two-hybrid screen. (A) Diagrammatic representation of the main functional domains of Snail and LOX-like proteins. (Left) Snail organization: N-half part (N-t) used as bait in the two-hybrid screen, containing the N-terminal SNAG domain, the destruction box (DB) and the NES domain. (Right) LOX-like proteins organization: N-terminal region specific to each family member and C-terminal catalytic region common to LOX and LOXL enzymes. (B) Specificity of interactions between Snail (N-t) and LOX and LOXL1 (catalytic domain) in the two-hybrid system. The isolated cDNAs from LOX and LOXL1 isoforms were tested for interaction with Snail in complete medium (middle) or in the absence of adenine and histidine and in the presence of X-αGal (right) at three serial dilutions. Interactions in the absence of bait and prey cDNAs and those between Snf1 and Snf4 cDNAs were tested in parallel as negative and positive controls, respectively. Download figure Download PowerPoint Figure 2.Expression of LOX and LOXL isoforms in mouse and human carcinoma cells. (A, B) The expression of LOX, the indicated LOXL isoforms and Snail was analyzed by RT–PCR in the indicated mouse (A) and (B) human cell lines. GAPDH mRNA levels were analyzed in parallel as a control of the amount of cDNAs. (C, D) LOXL2 and LOXL3 expression was analyzed by Western blot in the indicated mouse (C) and human (D) cell lines; α-tubulin levels were analyzed in parallel as a loading control. Download figure Download PowerPoint To confirm the molecular interaction suggested by the two-hybrid screen, we carried out co-immunoprecipitation analyses in HEK293T cells transiently transfected with tagged versions of Snail and LOXL2, LOXL3 or LOXL4 isoforms. Co-immunoprecipitation of LOXL2 and LOXL3, but not LOXL4, by Snail (Figure 3A, left panels) indicated an in vivo interaction between Snail and either LOXL2 or LOXL3. Furthermore, inverse co-immunoprecipitation analysis reinforced this notion (Figure 3A, right panels). Additional co-immunoprecipitation experiments carried out with several versions of Snail-HA containing different functional domains showed that LOXL2 interacts with the full-length Snail protein, but not with mutants lacking the N-terminal region (ΔNt) or just the first 9 amino acids (ΔSNAG) (Figure 3B), indicating that Snail interaction with LOXL2 requires the repressor SNAG domain (Peinado et al, 2004a). Similar results were obtained in Madin Darby canine kidney (MDCK) cells and in pulldown assays with LOXL2 or LOXL3 (data not shown). Unfortunately, Snail-HA lacking the C-terminal domain (ΔZn-HA) was highly unstable (Figure 3B, left panel) precluding confirmation of the interaction between LOXL2/3 and Snail N-terminal domain detected in the two-hybrid screen. On the other hand, confocal analysis of MDCK cells transiently transfected with tagged versions of the corresponding genes showed that LOXL2/3 and Snail colocalize in the perinuclear compartment (Figure 3C). The perinuclear localization has also been recently observed for LOXL1 in cell cultures (Liu et al, 2004). Taken together, these results show that LOXL2 and LOXL3 interact with Snail through the SNAG domain. Figure 3.Snail interacts with LOXL2 and LOXL3 isoforms. (A) HA-tagged Snail-wt (wild type) or Snail-K98R/K137R constructs were transiently coexpressed with LOXL2-, LOXL3- or LOXL4-flag isoforms in HEK293T cells. (Left panel) Snail immunoprecipitation with anti-HA and detection of LOXL isoforms by Western with anti-flag antibodies. Control IgG immunoprecipitation is also shown. Reversal immunoprecipitation (right panel) with anti-flag and detection of Snail-wt or Snail-K98R-K137R with anti-HA antibodies was performed. IgGs were used to confirm equal immunoprecipitation. The expression of Snail and LOXL isoforms was detected by Western blot in 5% of cell lysates (upper panel). (B) (Right) Co-immunoprecipitation analyses performed after transfection of LOXL2-flag and Snail-HA, or the indicated Snail deletion mutants, with anti-HA and detection of associated LOXL2 with anti-flag antibodies. (Left) Input fractions showing Snail-HA and mutants levels; α-tubulin was used as a loading control. Note the low levels of ΔZn-HA expression precluding its analyses in co-immunoprecipitation. (C) Confocal analyses of MDCK cells transiently transfected with Snail-HA (a, e) and either LOXL2- (b) or LOXL3-flag (f), showing the colocalization of Snail with LOXL2/3 in the perinuclear region (merge images, c, g; and d and h). Snail nuclear localization was confirmed by DAPI staining (i, j). Bar, 5 μm. Download figure Download PowerPoint LOXL2 and LOXL3 collaborate with Snail in E-cadherin repression To get an insight into the functionality of the identified Snail–LOXL2/3 interactions, we next analyzed the effect of human LOXL2 and LOXL3 on E-cadherin promoter activity in MDCK cells in the absence or presence of Snail. To observe a potential cooperation, Snail was transfected under partial repression conditions (50 ng) (Peinado et al, 2004a) (Figure 4A, lane 2). Transfection of human LOXL2 or LOXL3 cDNAs (300 ng) induced a partial repression of the E-cadherin promoter (Figure 4A, lanes 3 and 5) and cotransfection of Snail with either LOXL2 or LOXL3 led to a significant increase, up to 70%, in the repression activity (Figure 4A, lanes 4 and 6), indicating that LOXL2/3 proteins collaborate with Snail in E-cadherin promoter repression. Cotransfection of the ΔSNAG mutant indicated the requirement of the N-terminal SNAG domain for Snail repression and functional collaboration with LOXL2/3 (Figure 4A, lanes 7–9). Figure 4.K98 and K137 residues of Snail are required for its collaboration with LOXL2/3 in E-cadherin promoter repression. (A) E-cadherin promoter was transiently transfected in MDCK cells and the activity was measured in the presence of wild-type Snail or the ΔSNAG mutant (50 ng) in the absence or presence of LOXL2 or LOXL3 cDNAs (300 ng). (B) E-cadherin promoter activity was measured as above in MDCK-EGFPshRNA or MDCK-SnailshRNA stable cell lines in the absence or presence of Snail, LOXL2 or LOXL3. (C) Schematic diagrams of Snail and Slug proteins showing the localization of lysine residues K9, K16, K98 and K137; note the absence of K98 and the location of K137 in the first zing-finger domain of Slug. (D) The activity of the E-cadherin promoter in MDCK cells was measured as above in the absence or presence of the indicated individual mutant forms of Snail (50 ng) (lanes 3–6) or double mutants in the absence or presence of LOXL2 and LOXL3 cDNAs (300 ng), as indicated. The effect of Slug (100 ng) in the absence or presence of LOXL2/3 isoforms (300 ng) was also tested (lanes 11–13). (E) RT–PCR analyses for detection of endogenous E-cadherin transcripts after transient transfection of the indicated plasmids as above. Levels of GAPDH transcript were used as a control of cDNA loading; densitometry of E-cadherin/GAPDH ratio of two independent experiments is shown. Download figure Download PowerPoint To confirm if the moderate E-cadherin promoter repression triggered by LOXL2 or LOXL3 might be caused by cooperation with the endogenous Snail (Peinado et al, 2003), E-cadherin promoter activity was assayed in MDCK cells stably transfected with either SnailshRNA or control EGFPshRNA. Expression of LOXL2 or LOXL3 in MDCK-SnailshRNA cells had no effect on E-cadherin promoter activity (Figure 4B, lanes 6 and 7, compare with lanes 2 and 3). Analysis of E-cadherin promoter in Snail-deficient MCA3D cells showed a very low repressive effect of LOXL2/3 (Supplementary data S2a). Together, these data suggest that LOXL2/3 enzymes can functionally cooperate with Snail in E-cadherin repression as a consequence of their physical interaction through the SNAG domain. Snail Lys98 and Lys137 residues are essential for E-cadherin silencing, induction of EMT and Snail stability Since LOXL enzymes exert their function by modification of specific peptidyl lysine residues, we analyzed the conserved lysine residues in the Snail subfamily of repressors (Sefton et al, 1998) and found that four of them (K9, K16, K98 and K137) are located within the N-terminus fragment used as bait in the protein interaction screen (Figure 4B). To determine if Snail's lysine residues could be required for collaboration with LOXL enzymes, we carried out site-directed mutagenesis of K9, K16, K98 and K137 residues that were replaced by arginine and the mutants were used in E-cadherin promoter assays. None of the individual mutations affected E-cadherin promoter repression mediated by Snail (Figure 4D, lanes 3–6, compare with lane 2) or the collaboration with LOXL2/3 (Supplementary data S1). Next, we analyzed the consequence of the double mutations K9R/K16R and K98R/K137R on Snail repressor activity. The K9R/K16R mutant exhibited a behavior similar to that of the wild-type Snail (Figure 4D, lane 7) and partly relieved the cooperation with LOXL2/3 (Supplementary data S1), probably because it altered the ability to recruit corepressor complexes. In contrast, the double mutant K98R/K137R, although with a conserved intact SNAG domain, was unable to repress the E-cadherin promoter activity (Figure 4D, lane 8) and failed to collaborate with LOXL2/3 (Figure 4D, lanes 9 and 10). Analysis of the effect on endogenous E-cadherin mRNA levels confirmed the collaboration of Snail and LOXL2/3 and the strict requirement of Snail's K98 and K137 residues for E-cadherin repression (Figure 4E). The unsuccessful collaboration of Snail K98R/K137R mutant with LOXL2/3 is not due to a lack of interaction, since the double mutant maintains interaction with either LOXL2 or LOXL3 (Figure 3A). However, the Snail K98R/K137R mutant has impaired ability to recruit corepressor complexes; decreased interaction with mSin3A and HDAC1/2 components has been detected (Supplementary data S2b, and data not shown). Altogether, these results indicate that K98 and K137 residues are essential for Snail to achieve its full repressor capability and suggest that these residues could be the substrates of LOXL2/3 enzymes. Since both Snail and Slug members of the Snail superfamily have been described as repressors of E-cadherin, it is possible that Slug could also be modified by LOXL2/3. Interestingly, K9 and K16 residues are fully conserved in the Snail superfamily, but K98 is replaced by arginine in the Slug subfamily and K137, although conserved, is located in a very different sequence context being embedded in the first zinc-finger domain of Slug (Sefton et al, 1998) (Figure 4C), suggesting that Slug members would not collaborate with LOXL2/3 in silencing E-cadherin promoter. To confirm this assumption, we carried out E-cadherin promoter assays with mouse Slug in the absence and presence of LOXL2/3. Transfection of Slug led to a moderate level of E-cadherin promoter repression in MDCK cells even when used at higher doses (100 ng) than Snail (50 ng) (Figure 4D, compare lanes 11 and 2), in agreement with previous observations (Bolos et al, 2003). No collaboration of LOX2/3 with Slug could be detected over a range of Slug concentration (50–250 ng) (Figure 4C, lanes 11–13, and unpublished data), supporting that, in contrast to Snail, Slug would not require interaction/modification by LOXL2/3 to be active. These data indicate that Snail and Slug use different mechanisms to repress E-cadherin transcription, unveiling the existence of functional differences between the Snail and Slug subfamilies. To further explore whether the Snail K98R/K137R mutation has any in vivo consequence, we evaluated the competence of the mutant Snail to achieve EMT. To this end, MDCK cells were stably transfected with HA-tagged variants of Snail and Snail-K98R/K137R. MDCK cells expressing Snail-HA suffered EMT with complete loss of E-cadherin (Figure 5A and B), while cells expressing the double mutant exhibited an unaltered epithelial phenotype (95% of the clones) similar to that of the mock-control cells (Figure 5A, compare panelse and f with i and j) and maintained the expression of E-cadherin (Figure 5B) organized in cell–cell junctions (Figure 5A, compare panels g and h with k and l). These results reinforce the requirement of intact K98 and K137 residues for Snail-mediated EMT. Figure 5.Lysine residues K98 and K137 of Snail are required for EMT induction. (A) MDCK transfectants obtained after stable expression of Snail-HA (upper panels), Snail-K98R/K137R-HA (middle panels) or pcDNA3-HA control vector (lower panels) were characterized by phase contrast of subconfluent cultures (left panels) and immunofluorescence of E-cadherin (right panels). Two independent clones, out of 20, from each transfection are shown. Bars, 40 μm. (B) Western blot analyses performed on whole cell extracts for the expression of E-cadherin and Snail-HA proteins in the indicated MDCK clones. Detection of α-tubulin was used as a loading control. Download figure Download PowerPoint The K98 and K137 residues are flanking the Snail NES domain (Dominguez et al, 2003) and the K98 residue (K99 in human Snail) is located inside the conserved destruction box (DSGKSS) recently reported to be required for GSK3β-dependent phosphorylation and proteasome degradation of Snail (Zhou et al, 2004). We, therefore, analyzed the stability of wild-type and variant K98R/K137R Snail proteins after transient transfection in HEK293T cells. The mutant K98R/K137R protein exhibits a slightly lower stability than wild-type Snail (Figure 6A and C), which is in agreement with recent reports (Yook et al, 2005). Strikingly, coexpression of LOXL2 led to an increased stability of wild-type Snail while it strongly decreased the stability of the mutant K98R/K137R Snail (Figure 6B and D), an effect that can be prevented by pretreatment with GSK3β and proteasome inhibitors (data not shown). We next evaluated the interaction of wild-type Snail and mutant K98R/K137R protein with GSK3β and their ubiquitination degree. The K98R/K137R mutant protein exhibited a higher degree of interaction with GSK33β and ubiquitination than the wild-type Snail (Figure 6E), in agreement with its highest instability. These data indicate that K98 and K137 residues are crucial for Snail stability and suggest that interaction/modification with LOXL2/3 might prevent its degradation and/or nuclear export, therefore increasing its functional transcription activity. Figure 6.Lysine residues K98 and 137 are crucial for Snail protein stability. HEK293T cells transiently transfected with wild-type or variant K98R/K137R Snail in the absence (A) or presence (B) of LOXL2 were treated with 20 μM cycloheximide for the indicated time intervals and whole cell extracts analyzed by Western blotting. (C, D) Densitometric analysis of blots shown in panels A and B, respectively. Results show the mean±s.d. of two independent experiments. (E) (Right) Immunoprecipitation analysis of Snail wild type or K98R/K137R-HA performed with anti-HA and detection of associated GSK3β or the ubiquitination level by Western blot. IgGs were used as a control to confirm equal immunoprecipitation. The expression level of Snail and GSK3β proteins was detected in 5% of cell lysates (left panel). Download figure Download PowerPoint LOXL2 and LOXL3 induce EMT To further analyze the role of LOXL2 and LOXL3 in E-cadherin downregulation in vivo, we examined the phenotype of MDCK cells stably expressing each of the human enzymes. As a control, we analyzed MDCK cells either transfected with the empty vector (CMV) (Cano et al, 2000) or expressing the human LOXL4 that exhibit an unaltered epithelial phenotype, maintaining growth in an epithelial monolayer (Figure 7Ac) and the expression of E-cadherin (Figure 7B and C) in organized cell–cell junctions (Figure 7Af). No expression of the mesenchymal marker fibronectin was observed in MDCK-hLOXL4 cells (Figure 7B) and vimentin exhibited a distribution (Figure 7Al) typical of control MDCK cells in culture (Cano et al, 2000). In striking contrast, stable expression of hLOXL2 or hLOXL3 in MDCK cells induced a conversion to a fibroblastic/spindle phenotype (Figure 7Aa and b) and vimentin exhibited an organization typical of mesenchymal cells (Figure 7Aj and k). Although both hLOXL2 and hLOXL3 showed a similar expression pattern (Figure 7Ag and h), the EMT effect seems to be stronger in hLOXL2-transfected cells than in hLOXL3-transfected cells. While MDCK-hLOXL2 cells do not express E-cadherin (Figure 7Ad, B and C) and show an induction of fibronectin (Figure 7B), MDCK-hLOXL3 cells still express E-cadherin mRNA and protein, although at reduced levels (Figure 7B and C) and with a disorganized distribution (Figure 7Ae), and do not express fibronectin (Figure 7B). No changes in the expression level of endogenous Snail transcripts were observed in the MDCK-LOX2/3 transfectants (data not shown). To discard a post-transcriptional regulation of E-cadherin by LOXL2/3, we investigated the effect of proteasome inhibition in the different cell lines (Figure 7D) finding no significant differences in the E-cadherin protein levels. Figure 7.Stable expression of LOXL2 or LOXL3 in MDCK cells induces EMT. (A) Characterization of MDCK transfectants obtained after stable expression of hLOXL2 (left panels), hLOXL3 (middle panels) and LOXL4 (right panels) by phase contrast (a–c), and immunofluorescence for the expression of E-cadherin (d–f), ectopically expressed LOXL isoform (g–i) and vimentin (j–l) in the indicated cell clones. Bars, 40 μm. (B) Western blot analyses performed on whole cell extracts for the expression of E-cadherin, fibronectin and ec