ABSTRACT An escalating pandemic caused by the novel severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is impacting global health. Specific treatment options for diseases caused by SARS-CoV-2 are largely lacking. Herein, we used a pseudotype virus (pv) bearing the SARS-CoV-2 S glycoprotein to screen a botanical drug library to identify an agent against SARS-CoV-2 entry. All the four hits, including angeloylgomisin O, schisandrin B, procyanidin, and oleanonic acid, were identified for effective inhibition of SARS-CoV-2 S pv entry in the micromolar range. A mechanistic study revealed that these four agents inhibit SARS-CoV-2 S pv entry by blocking S-mediated membrane fusion. Furthermore, angeloylgomisin O, schisandrin B, and oleanonic acid inhibited authentic SARS-CoV-2 with a high selective index (SI). We also showed that all the four hits could also inhibit the entry of pv of Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and newly emerged SARS-CoV-2 variants (D614G, K417N/E484K/N501Y/D614G). In drug combination studies performed in cellular antiviral assays, angeloylgomisin O and schisandrin B displayed synergistic effects in combination with remdesivir. These results indicated that angeloylgomisin O, schisandrin B, procyanidin, and oleanonic acid can inhibit SARS-CoV-2 and that they are potential therapeutic agents for COVID-19.

Abstract Lassa virus (LASV) belongs to the Mammarenavirus genus (family Arenaviridae) and causes severe hemorrhagic fever in humans. The glycoprotein precursor (GPC) contains eleven N-linked glycans that play essential roles in GPC functionalities such as cleavage, transport, receptor recognition, epitope shielding, and immune response. We used three mutagenesis strategies to abolish the individual glycan chains on the GPC and found that all three mutations led to cleavage inefficiency on the 2 nd , 5 th , and 8 th glycosylation motifs. To evaluate N to Q mutagenesis for further research, it was found that deletion of the 2 nd and 8 th glycans completely inhibited the infectivity. We further investigated the role of glycans on GPC-mediated immune response by DNA immunization of mice. Deletion of the individual 1 st , 3 rd , 5 th and 6 th glycans significantly enhanced the proportion of effector CD4+ cells, whereas deletion of the 1 st , 2 nd , 3 rd , 4 th 5 th , 6 th , and 9 th glycans enhanced the proportion of CD8+ effector T cells. Deletion of specific glycans improves the Th1-type immune response, and abolishment of glycan on GPC generally increases the antibody titer to the glycan-deficient GPC. However, the antibodies from either the mutant or WT GPC-immunized mice show little neutralization effect on wild-type LASV. The glycan residues on GPC provide an immune shield for the virus, and thus represent a target for the design and development of a vaccine. Importance At present, there are no Food and Drug Administration-approved drugs or vaccines specific for LASV. Similar to other enveloped viruses with a heavy glycan shield, the N-linked glycans of LASV make it difficult for effector T cells and neutralization antibodies to access the glycoprotein epitope. In this study, we evaluated the effect of the individual glycan chains on GPC-mediated immune response, and found that deletion of the glycan improves the proportion of effector T cells, improving the Th1-type immune response, and increasing the antibody titer to the WT and mutant GPC, which may be beneficial to vaccine design and development.

ABSTRACT Lassa virus (LASV) is an enveloped, negative-sense RNA virus that causes Lassa hemorrhagic fever, for which there are limited treatment options. Successful LASV entry requires the viral glycoprotein 1 (GP1) to undergo a receptor switch from its primary receptor alpha-dystroglycan (α-DG) to its endosomal receptor lysosome-associated membrane protein 1 (LAMP1). A conserved histidine triad in LASV GP1 has been reported to be responsible for receptor switch. To test the hypothesis that other non-conserved residues also contribute to receptor switch, we constructed a series of GP1 mutant proteins and tested them for binding to LAMP1. Four residues, L84, K88, L107, and H170, were identified as critical for receptor switch. Substituting any of the four residues with the corresponding lymphocytic choriomeningitis virus residue (L84N, K88E, L10F, and H170S) reduced the binding affinity of GP1 LASV for LAMP1. Moreover, all the mutations caused decreases in GPC-mediated membrane fusion at both pH 4.5 and 5.2. The infectivity of pseudotyped viruses bearing either GPC L84N or GPC K88E decreased sharply in multiple cell types, whereas L107F and H170S had only mild effects on infectivity. Notably, in LAMP1 knockout cells, all four mutants showed reduced pseudovirus infectivity. Using biolayer light interferometry assay, we found that all four mutants had decreased binding affinity to LAMP1, in the order L84N > L107F > K88E > H170S. IMPORTANCE Lassa virus requires pH-dependent receptor switch to infect host cells; however, the underlying molecular mechanisms of this process are not well known. Here, we identify four residues, L84, K88, L107, and H170 that contribute to the interaction with the second receptor lysosome-associated membrane protein 1 (LAMP1). Mutant any of the four residues would impair the binding affinity to LAMP1, decrease the glycoprotein mediated membrane fusion, and reduce the pseudovirus infectivity.

Black rockfish (Sebastes schlegelii) is a teleost species where eggs are fertilized internally and retained in the maternal reproductive system, where they undergo development until live birth (termed viviparity). In the present study, we report a chromosome-level black rockfish genome assembly. High-throughput transcriptome analysis (RNA-seq and ATAC-seq), coupled with in situ hybridization (ISH) and immunofluorescence, identify several candidate genes for maternal preparation, sperm storage and release, and hatching. We propose that zona pellucida (ZP) genes retain sperm at the oocyte envelope, while genes in two distinct astacin metalloproteinase subfamilies serve to release sperm from the ZP and free the embryo from chorion at pre-hatching stage. Finally, we present a model of black rockfish reproduction, and propose that the rockfish ovarian wall has a similar function to uterus of mammals. Taken together, these genomic data reveal unprecedented insights into the evolution of an unusual teleost life history strategy, and provide a sound foundation for studying viviparity in non-mammalian vertebrates and an invaluable resource for rockfish ecology and evolution research.

Abstract Lassa virus (LASV) belongs to the Old World Mammarenavirus genus (family Arenaviridae ) and is classified as a category A biological threat agent. At present, there are no approved drugs or vaccines specific for LASV. In this study, high-throughput screening of a botanical drug library was performed against LASV entry using a pseudotype virus bearing the LASV envelope glycoprotein (GPC). Two hit compounds, bergamottin and casticin, were identified as LASV entry inhibitors in the micromolar range. A mechanistic study revealed that casticin inhibited LASV entry by blocking low pH-induced membrane fusion. Adaptive mutant analyses demonstrated that the F446L mutation, located in the transmembrane domain of GP2, conferred resistance to casticin. Furthermore, casticin extended its antiviral spectrum to the New World (NW) pathogenic mammarenaviruses, and mutation of the conserved F446 conferred NW resistance to casticin. Unlike casticin, bergamottin has little effect on LASV GPC-mediated membrane fusion, while it inhibited LASV entry by blocking endocytic trafficking. Our study shows that both bergamottin and casticin are candidates for LASV therapy, indicating that the conserved F446 plays important roles in drug resistance in mammarenaviruses. IMPORTANCE Currently, there is no approved therapy to treat Lassa fever (LASF); we aimed to find candidates for LASF therapy. Herein, we screened a botanical drug library and identified two compounds, bergamottin and casticin, that inhibited LASV entry via different mechanisms.

Abstract Currently, there are no approved drugs for the treatment of flavivirus infection. Accordingly, we tested the inhibitory effects of the novel θ-defensin retrocyclin-101 (RC-101) against flavivirus infection, and investigated the mechanism underlying the potential inhibitory effects. First, RC-101 robustly inhibited both Japanese encephalitis virus (JEV) and Zika virus (ZIKV) infections. RC-101 exerted inhibitory effects on the entry and replication stages. Results also indicated that the non-structural protein NS2B-NS3 serine protease might serve as a potential viral target. Further, RC-101 inhibited protease activity at the micromolar level. We also demonstrated that with respect to the glycoprotein E protein of flavivirus, the DE loop of domain III, which is the receptor-binding domain of the E protein, might serve as another viral target of RC-101. Moreover, a JEV DE mutant exhibited resistance to RC-101, which was associated with deceased binding affinity of RC-101 to DIII. These findings provide a basis for the development of RC-101 as a potential candidate for the treatment of flavivirus infection. Importance RC has been reported to have a broad-spectrum antimicrobial activity. In this study, we firstly report that RC-101 could inhibit ZIKV and JEV infections. Moreover, both the NS2B-NS3 serine protease and the DE loop in the E glycoprotein might serve as the viral targets of RC-101.

ABSTRACT Lassa virus (LASV) glycoprotein complex (GPC) contains retained stable-signal peptide (SSP), GP1, and GP2. SSP interacts with GP2 and provides an interface targeted by numerous fusion inhibitors. Serially passaging of LASV with inhibitors allowed some adaptive mutants to be obtained of which most had mutations located in the transmembrane (TM) domain of GP2. In the current study, we focused on the F446L mutant, which is reported to confer resistance to ST-series inhibitors. We found that F446L conferred cross-resistance to structurally distinct inhibitors. Furthermore, F446L increased the fusion activities of LASV and Mopeia virus GPC, elevating the pH threshold for fusion of LASV and promoting fusion of MOPV at neutral pH. F446L exerted little effect on the pseudotype viral growth profile or thermostability. By introducing other residues to the conserved F446 locus, it was found that this site was less compatible with a similar tyrosine residue and was intolerable to charged residues. These results help characterize the fusion inhibitor target located in the TM domain of GP2, which should be useful for drug and vaccine design. IMPORTANCE The LASV SSP-GP2 interface provides an Achilles heel that is targeted by numerous inhibitors. However, the emergence of resistant viruses is a major concern for direct antiviral drugs. In this study, we investigated the F446L mutant located in the GPC TM domain to determine the relationship between drug resistance, membrane fusion activity, viral growth kinetics, and thermostability. These results will be helpful in monitoring drug-resistant variants, as well as the advancement of drug and vaccine design.

Abstract Lassa virus (LASV) belongs to the Old World genus Mammarenavirus , family Arenaviridae , and order Bunyavirales . Arenavirus contains a segmented negative-sense RNA genome, which is in line with the bunyavirus and orthomyxoviruses. The segmented negative-sense RNA viruses utilize a cap-snatching strategy to provide primers cleavaged from the host capped mRNA for viral mRNA transcription. As a similar strategy and the conformational conservation shared with these viruses, the endonuclease (EN) would serve as an attractive target for developing broad-spectrum inhibitors. Using the LASV minigenome (MG) system, we screened a fragment-based drug development library and found three candidates (F1204, F1781, and F1597) inhibited MG activity. All three candidates also inhibited the prototype arenavirus Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) MG activity. Furthermore, the investigation revealed that two benzotriazole compounds (F1204 and F1781) effectively inhibited authentic LCMV and severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV) infections. The combination of either compound with an arenavirus entry inhibitor had significant synergistic antiviral effects. Moreover, both F1204 and F1781 were found to exert the binding ability of LASV EN with binding affinity at the micromolar level. These findings provide a basis for developing benzotriazole compounds as potential candidates for the treatment of segmented negative-sense RNA virus infections. Importance Cap-snatching is the mRNA transcription strategy shared by all the segmented, negative-sense RNA viruses. Using a fragment-based drug development (FBDD) library, we tried to screen out the backbone compound to inhibit the endonuclease activity and thus block this kind of virus infection. Two benzotriazole compounds, F1204 and F1781, were identified to inhibit the Lassa virus (LASV) minigenome activity by targeting the LASV EN.

ABSTRACT The Lujo virus (LUJV) belongs to the Old World (OW) genus Mammarenavirus (family Arenaviridae); it is categorized as a biosafety level (BSL) 4 agent. Currently, there are no U.S. Food and Drug Administration (FDA)-approved drugs or vaccines specifically for LUJV or other pathogenic OW mammarenaviruses. Here, a high-throughput screening of an FDA-approved drug library was conducted using pseudotype viruses bearing LUJV envelope glycoprotein (GPC) to identify inhibitors of LUJV entry. Three hit compounds, trametinib, manidipine, and lercanidipine, were identified as LUJV entry inhibitors in the micromolar range. Mechanistic studies revealed that trametinib inhibited LUJV GPC-mediated membrane fusion by targeting C410 (located in the transmembrane (TM) domain), while manidipine and lercanidipine inhibited LUJV entry by acting as calcium channel blockers. Meanwhile, all three hits extended their antiviral spectra to the entry of other pathogenic mammarenaviruses. Furthermore, all three could inhibit the authentic prototype mammarenavirus, lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), and could prevent infection at the micromolar level. This study shows that trametinib, manidipine, and lercanidipine are candidates for LUJV therapy, and highlights the critical role of calcium in LUJV infection. The presented findings reinforce the notion that the key residue(s) located in the TM domain of GPC provide an entry-targeted platform for designing mammarenavirus inhibitors. IMPORTANCE To date, only one LUJV outbreak has been recorded; it occurred in 2008 and resulted in a fatality rate of 80% (4/5 cases). Pathogenesis studies and therapeutic strategies are therefore urgently needed. Repurposing approved drugs can accelerate the development of drug design and facilitate the understanding of infectious mechanisms. Here, three compounds, trametinib, manidipine, and lercanidipine, were identified as entry inhibitors against LUJV. Studying the underling mechanisms revealed that a key residue (C410) in LUJV GPC modulates its sensitivity/resistance to trametinib and demonstrated the critical role of calcium in LUJV infection.

Cartilaginous fishes have a very high phenotypical diversity, a phenomenon for which the mechanisms have been largely unexplored. Here, we report the genome of the white-spotted bamboo shark as the first chromosome-level genome assembly of cartilaginous fish. Using this genome, we illustrated a dynamic chromosome rearrangement process in the bamboo shark, which resulted in the formation of 13 chromosomes, all of which were sparsely distributed with conserved genes and fast-evolving. We found the fast-evolving chromosomes to be enriched in immune-related genes with two chromosomes harboring the major genes for developing the single-chain antibody. We also found chromosome rearrangements to have resulted in the loss of two genes (p2rx3 and p2rx5) which we also showed were involved in cartilage development using a CRISPR/Cas9 approach in zebrafish. Our study highlighted the significance of chromosome rearrangements in the phenotypical evolution of cartilaginous fishes, providing clues to inform further studies on mechanisms for fish diversification.