Abstract Airway macrophages (AMs) are key regulators of the lung environment and are implicated in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), a fatal respiratory disease with no cure. However, the epigenetics of AMs development and function in IPF are limited. Here, we characterised the DNA-methylation (DNAm) profile of AMs from IPF (n=30) and healthy (n=14) donors. Our analysis revealed epigenetic heterogeneity was a key characteristic of IPF AMs. DNAm ‘clock’ analysis indicated epigenetic alterations in IPF-AMs was not associated with accelerated ageing. In differential DNAm analysis, we identified numerous differentially methylated positions (DMPs, n=11) and regions (DMRs, n=49) between healthy and IPF AMs respectively. DMPs and DMRs encompassed genes involved in lipid ( LPCAT1 ) and glucose ( PFKB3 ) metabolism and importantly, DNAm status was associated with disease severity in IPF. Collectively, our data identify that profound changes in the epigenome underpin the development and function of AMs in the IPF lung.

Fibroblastic foci (FF) represent the cardinal pathogenic lesion in idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) and comprise activated fibroblasts and myofibroblasts, the key effector cells responsible for dysregulated extracellular matrix deposition in multiple fibrotic conditions. The aim of this study was to define the major transcriptional programmes involved in fibrogenesis in IPF by profiling un-manipulated myo/fibroblasts within FF in situ by laser capture microdissection. The challenges associated with deriving gene calls from low amounts of RNA and the absence of a meaningful comparator cell type were overcome by adopting novel data mining strategies and by using weighted gene co-expression network analysis (WGCNA), as well as an eigengene-based approach to identify transcriptional signatures which correlate with fibrillar collagen gene expression. WGCNA identified prominent clusters of genes associated with cell cycle, inflammation/differentiation, translation and cytoskeleton/cell adhesion. Collagen eigengene analysis revealed that TGF-β1, RhoA kinase and the TSC2/RHEB axis formed major signalling clusters associated with collagen gene expression. Functional studies using CRISPR-Cas9 gene edited cells demonstrated a key role for the TSC2/RHEB axis in regulating TGF-β1-induced mTORC1 activation and collagen I deposition in mesenchymal cells reflecting IPF and other disease settings, including cancer-associated fibroblasts. These data provide strong support for the human tissue-based and bioinformatics approaches adopted to identify critical transcriptional nodes associated with the key pathogenic cell responsible for fibrogenesis in situ and further identifies the TSC2/RHEB axis as a potential novel target for interfering with excessive matrix deposition in IPF and other fibrotic conditions.

Idiopathic pulmonary fibrosis is a progressive and fatal interstitial lung disease. We aimed to determine if patient response to a palliative assessment survey could predict disease progression or death. We undertook a cross-sectional study in a UK clinical cohort of incident cases. Rasch-based methodology provided a disease distress value from an abridged 11 item model of the original 45 item survey. Distress values were compared with measures of lung function. Disease progression or mortality alone was predicted at twelve months from survey completion, with risk of death assessed at three, six and twelve months. Disease distress values were negatively correlated with lung function (r=-0.275 percent predicted DLCO). Expected survey scores computed from distress values could distinguish disease progression, 8.8 (p=0.004), and people who died, 10.2 (p=0.002), from those who did not progress, 6.9. Actual survey scores predicted disease progression and mortality with an area under the curve of 0.60 and 0.64, respectively. Each point increment in actual score increased risk of twelve-month mortality by 10%, almost 43% of people scoring above 18 did not survive beyond 105 days. We define a short questionnaire that can score disease distress and predict prognosis, assisting clinical decision making in progressive fibrosis. Clinical trial registration ID #:NCT01134822.

Rationale: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a complex lung disease characterised by scarring of the lung that is believed to result from an atypical response to injury of the epithelium. The mechanisms by which this arises are poorly understood and it is likely that multiple pathways are involved. The strongest genetic association with IPF is a variant in the promoter of MUC5B where each copy of the risk allele confers a five-fold risk of disease. However, genome-wide association studies have reported additional signals of association implicating multiple pathways including host defence, telomere maintenance, signalling and cell-cell adhesion. Objectives: To improve our understanding of mechanisms that increase IPF susceptibility by identifying previously unreported genetic associations. Methods and measurements: We performed the largest genome-wide association study undertaken for IPF susceptibility with a discovery stage comprising up to 2,668 IPF cases and 8,591 controls with replication in an additional 1,467 IPF cases and 11,874 controls. Polygenic risk scores were used to assess the collective effect of variants not reported as associated with IPF. Main results: We identified and replicated three new genome-wide significant (P<5×10−8) signals of association with IPF susceptibility (near KIF15 , MAD1L1 and DEPTOR ) and confirm associations at 11 previously reported loci. Polygenic risk score analyses showed that the combined effect of many thousands of as-yet unreported IPF risk variants contribute to IPF susceptibility. Conclusions: Novel association signals support the importance of mTOR signalling in lung fibrosis and suggest a possible role of mitotic spindle-assembly genes in IPF susceptibility.

Background: Repetitive alveolar damage and aberrant repair may be important in the development of the fatal condition Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF). The role played by microorganisms in this cycle is unknown. Methods: We consecutively enrolled patients diagnosed with IPF according to international criteria together with healthy smokers, non-smokers and subjects with moderate Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) as controls. Subjects underwent bronchoalveolar lavage (BAL) from which genomic DNA was isolated. The V3-V5 region of the bacterial 16S rRNA gene was amplified, allowing quantification of bacterial load and identification of communities by 16S rRNA qPCR and pyrosequencing. Results: Our 65 IPF patients had 3.9x109 copies of the 16S rRNA gene per ml of BAL, two-fold more than the 1.8x109 copies in 44 sex- and smoking-matched controls (P<0.0001). Baseline BAL bacterial burden predicted Forced Vital Capacity (FVC) decline (P=0.02). Patients in the highest tertile of bacterial burden were at a higher risk of mortality compared to subjects in the lowest tertile (hazard ratio 4.59 (95% CI, 1.05-20); P=0.04). Sequencing yielded 912,883 high quality reads from all subjects. Operational Taxonomic Units (OTUs) representing Haemophilus, Streptococcus, Neisseria and Veillonella were 1.5 to 3.5 fold more abundant in cases than controls (P<0.05). Regression analyses indicated that these specific OTUs as well as bacterial burden associated independently with IPF. Conclusions: IPF is characterised by an increased bacterial burden in BAL that predicts decline in lung function and death. Clinical trials of antimicrobial therapy may determine if microbial burden is causal or not in IPF progression.

Background

 There is a breadth of evidence supporting a key role for abnormal B-cell function in the pathogenesis of systemic sclerosis and associated interstitial lung disease (SSc-ILD) ^[1,2]. A previous pilot study investigated the efficacy of belimumab, a recombinant human immunoglobulin G1 lambda (IgG1λ) monoclonal antibody that binds to and neutralises B-lymphocyte stimulator (BLyS) subsequently inhibiting the survival of B cells ^[3], in reducing modified Rodnan skin score (mRSS) in 20 patients with SSc ^[4]. Belimumab is well tolerated and is approved for the treatment of patients with active systemic lupus erythematosus and active lupus nephritis receiving standard therapy ^[5]. We hypothesise that by reducing the number of B cells and dampening B-cell effector functions in the circulation and tissue, belimumab will reduce inflammation and fibrosis across multiple organ systems in patients with SSc. This will result in the stabilisation of, and/or reduction in, lung function decline and skin thickening in SSc, and improvements in patients’ quality of life. 

Objectives

 To present the design of a randomised controlled trial that will evaluate the efficacy and safety of subcutaneous (SC) belimumab versus placebo in adult patients with SSc-ILD. 

Methods

 In this global, parallel-group, Phase 2/3, randomised, double-blind, placebo-controlled, two-arm, 52-week study (GSK Study 218224), eligible adults with a documented diagnosis of SSc and ILD (as confirmed by high-resolution computed tomography) will be randomised 1:1 to receive either belimumab 200 mg SC weekly (Arm 1), or matching SC placebo weekly (Arm 2), for 52 weeks (Figure 1). Participants will be permitted to continue their stable doses of standard therapy throughout the study. The primary endpoint of the study is absolute change from baseline in forced vital capacity (ml) at Week 52. Key secondary endpoints, analysed at Week 52, include: absolute change from baseline in mRSS, absolute change from baseline in Functional Assessment of Chronic Illness Therapy (FACIT)-Fatigue score, and SSc progression or death. Patient-reported outcomes (listed in the Figure 1) will also be assessed. A comprehensive biomarker approach will be implemented to evaluate the belimumab modulating effects on key biological processes involved in SSc pathogenesis (fibrosis and inflammation) in circulation and in skin biopsies. Safety will be monitored throughout the study. 

Results

 Target sample size is planned to be approximately 300 patients, with 150 patients per arm. 

Conclusion

 We present the design of a global Phase 2/3 study that will test the efficacy and safety of SC belimumab in patients with SSc-ILD. Together, the study endpoints enable the assessment of the efficacy of belimumab on a broad range of disease manifestations, disease progression, and impact on patient burden and survival. 

References

 [1]Thoreau B et al. Front Immunol 2022;13:933468 [2]Ebata S et al. J Dermatol 2022;49:179–83 [3]Huang W et al. JCI Insight 2018;3:e122525 [4]Gordon JK et al. Arthritis Rheumatol 2018;70:308–16 [5]GSK. Benlysta US prescribing information. 2022 [6]van den Hoogen F et al. Ann Rheum Dis 2013;72:1747–55 

Acknowledgements

 Study funded by GSK (GSK Study 218224). Medical writing support was provided by Olivia Hill, MPharmacol, Fishawack Indicia Ltd, UK, part of Fishawack Health, and was funded by GSK. 

Disclosure of Interests

 Christopher P Denton Speakers bureau: Janssen; Boehringer Ingelheim, Consultant of: GSK, CSL Behring, Boehringer Ingelheim, Merck, Roche, Sanofi, Grant/research support from: GSK, CSL Behring, Inventiva, Horizon, Robert Spiera Consultant of: GSK, Regeneron, Abbvie, Sanofi, Chemocentryx, Novartis, Galderma, Vera, Chemomab, Boehringer Ingelheim, BMS, Grant/research support from: Roche-Genentech, AstraZeneca, GSK, Kadmon, Boehringer Ingelheim, Chemocentryx, Corbus, Formation Biologics, Novartis, Inflarx, Principia, Distler Jörg Speakers bureau: AbbVie, AstraZeneca, Bayer Pharma, Boehringer Ingelheim, Janssen and UCB, Consultant of: AbbVie, Active Biotech, Anamar, ARXX, AstraZeneca, Bayer Pharma, Boehringer Ingelheim, Celgene, Galapagos, GSK, Inventiva, Janssen, Novartis, Pfizer, and UCB, Grant/research support from: Anamar, ARXX, BMS, Bayer Pharma, Boehringer Ingelheim, Cantargia, Celgene, CSL Behring, Galapagos, GSK, Inventiva, Kiniksa, Sanofi-Aventis, Tanabe-Mitsubishi RedX, UCB, Employee of: JHWD is stock owner of 4D Science and Scientific Lead of FibroCure, Dinesh Khanna Speakers bureau: Janssen, Consultant of: Actelion, Amgen, Boehringer Ingelheim, GSK, Horizon, Janssen, Prometheus, Talaris, Grant/research support from: BMS, Pfizer, Boehringer Ingelheim, Michael Kreuter Speakers bureau: Boehringer Ingelheim, Roche, Consultant of: Boehringer Ingelheim, Roche, GSK, Grant/research support from: Boehringer Ingelheim, Roche, Masataka Kuwana Speakers bureau: Abbvie, Asahi-Kasei, Astellas, Boehringer Ingelheim, Chugai, Eisai, MBL, Mochida, Nippon Shinyaku, Ono Pharmaceuticals, Tanabe-Mitsubishi, Consultant of: AstraZeneca, Boehringer Ingelheim, Chugai, Corbus, GSK, Horizon, Tanabe-Mitsubishi, Grant/research support from: Boehringer-Ingelheim, Elizabeth Volkmann Speakers bureau: Former member of speakers bureau for Boehringer Ingelheim, Consultant of: Boehringer Ingelheim, Roche, GSK, Galderma, CLS Behring, Grant/research support from: Boehringer Ingelheim, Kadmon, Horizon, Prometheus, Jasna Cotic Employee of: GSK, Olaide Raji Employee of: GSK, Anne Hammer Shareholder of: GSK, Employee of: GSK, Chiara Zeccin Shareholder of: GSK, Employee of: GSK, Andre van Maurik Shareholder of: GSK, Employee of: GSK, Jose Miyar Olaiz Shareholder of: GSK, Employee of: GSK, William Fahy Employee of: GSK, Ryan Tomlinson Shareholder of: GSK, Employee of: GSK, Daniela Dastros-Pitei Shareholder of: GSK, Employee of: GSK, Svetlana Nihtyanova Shareholder of: GSK, Consultant of: Roche, Employee of: GSK, Elaine Irving Employee of: GSK, Toby Maher Speakers bureau: BI, Roche/Genentech,United Therapeutics, Consultant of: BI, Roche, AZ, BMS, GSK, Pfizer, Sanofi, United Therapeutics, Grant/research support from: AZ, GSK.

AIMS: To evaluate computer-derived (CALIPER) CT variables against FVC change as potential drug trials endpoints in IPF. METHODS: 71 Royal Brompton Hospital (discovery cohort) and 23 Mayo Clinic Rochester and 24 St Antonius Hospital Nieuwegein IPF patients (validation cohort) were analysed. Patients had two CTs performed 5-30 months apart, concurrent FVC measurements and were not exposed to antifibrotics (to avoid confounding of mortality relationships from antifibrotic use). Cox regression analyses (adjusted for patient age and gender) evaluated outcome for annualized FVC and CALIPER vessel-related structures (VRS) change and examined the added prognostic value of thresholded VRS changes beyond standard FVC change thresholds. RESULTS: Change in VRS was a stronger outcome predictor than FVC decline when examined as continuous variables, in discovery and validation cohorts. When FVC decline (greater or equal to 10%) and VRS thresholds were examined together, the majority of VRS change thresholds independently predicted outcome, with no decrease in model fit. When analysed as co-endpoints, a VRS threshold of greater or equal to 0.40 identified 30% more patients reaching an endpoint than a greater or equal to 10% FVC decline threshold alone. CONCLUSIONS: Change in VRS is a strong predictor of outcome in IPF and can increase power in future drug trials when used as a co-endpoint alongside FVC change.