Caspases are intracellular proteases that function as initiators and effectors of apoptosis. The kinase Akt and p21-Ras, an Akt activator, induced phosphorylation of pro–caspase-9 (pro-Casp9) in cells. Cytochrome c–induced proteolytic processing of pro-Casp9 was defective in cytosolic extracts from cells expressing either active Ras or Akt. Akt phosphorylated recombinant Casp9 in vitro on serine-196 and inhibited its protease activity. Mutant pro-Casp9(Ser196Ala) was resistant to Akt-mediated phosphorylation and inhibition in vitro and in cells, resulting in Akt-resistant induction of apoptosis. Thus, caspases can be directly regulated by protein phosphorylation.

Although the mechanism of mammalian apoptosis has not been elucidated, a protease of the CED-3/ICE family is anticipated to be a component of the death machinery. Several lines of evidence predict that this protease cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) to a specific 85 kDa form observed during apoptosis, is inhibitable by the CrmA protein, and is distinct from ICE. We cloned a ced-3/ICE-related gene, designated Yama, that encodes a protein identical to CPP32 beta. Purified Yama was a zymogen that, when activated, cleaved PARP to generate the 85 kDa apoptotic fragment. Cleavage of PARP by Yama was inhibited by CrmA but not by an inactive point mutant of CrmA. Furthermore, CrmA blocked cleavage of PARP in cells undergoing apoptosis. We propose that Yama may represent an effector component of the mammalian cell death pathway and suggest that CrmA blocks apoptosis by inhibiting Yama.

Apolipoprotein E (apoE), a plasma apolipoprotein that plays a central role in lipoprotein metabolism, is localized in the senile plaques, congophilic angiopathy, and neurofibrillary tangles of Alzheimer disease. Late-onset familial and sporadic Alzheimer disease patients have an increased frequency of one of the three common apoE alleles, epsilon 4, suggesting apoE4 is associated with increased susceptibility to disease. To follow up on this suggestion, we compared the binding of synthetic amyloid beta (beta/A4) peptide to purified apoE4 and apoE3, the most common isoform. Both isoforms bound synthetic beta/A4 peptide, the primary constituent of the plaque and angiopathy, forming a complex that resisted dissociation by boiling in SDS. Oxygen-mediated complex formation was implicated because binding was increased in oxygenated buffer, reduced in nitrogen-purged buffer, and prevented by reduction with dithiothreitol or 2-mercaptoethanol. Binding of beta/A4 peptide was saturable at 10(-4) M peptide and required residues 12-28. Examination of apoE fragments revealed that residues 244-272 are critical for complex formation. Both oxidized apoE4 and apoE3 bound beta/A4 peptide; however, binding to apoE4 was observed in minutes, whereas binding to apoE3 required hours. In addition, apoE4 did not bind beta/A4 peptide at pH < 6.6, whereas apoE3 bound beta/A4 peptide from pH 7.6 to 4.6. Together these results indicate differences in the two isoforms in complexing with the beta/A4 peptide. Binding of beta/A4 peptide by oxidized apoE may determine the sequestration or targeting of either apoE or beta/A4 peptide, and isoform-specific differences in apoE binding or oxidation may be involved in the pathogenesis of the intra- and extracellular lesions of Alzheimer disease.

Caspase-8 mediates apoptosis induced by 'death receptors' on the cell's surface. At the same time, it is able to prevent receptor interacting protein kinase (RIPK)-dependent necrosis. Without caspase-8, mice die during embryonic development, but why this happens is not clear. Two groups show that this lethality is not caused by the absence of apoptosis, but by the RIPK3-dependent necrosis that is unleashed without caspase-8. Mice lacking both caspase-8 and RIP3 develop into viable, immunocompetent adults, but have a progressive lymphoaccumulative disease similar to that in mice that lack the CD95 death receptor. Oberst et al. also show that caspase-8 forms a proteolytically active complex with FLICE-like inhibitory protein long (FLIPL), and that this complex is required for protection against RIP3-dependent necrosis. Caspase-8 mediates apoptosis induced by death receptors. At the same time, this protease is able to prevent RIP-dependent necrosis. Without caspase-8 mice die during their embryonic development. Two papers now show that lethality is not caused by the absence of apoptosis, but by RIP3-dependent necrosis that is unleashed without caspase-8. Mice that lack both caspase-8 and RIP3 develop into viable, immunocompetent, fertile adult mice, but suffer from a progressive lymphoaccumulative disease similar to mice that lack the death receptor CD95. This paper further shows that caspase-8 forms a proteolytically active complex with FLIPL, and that this complex is required for protection against RIP3-dependent necrosis. Caspase-8 has two opposing biological functions—it promotes cell death by triggering the extrinsic pathway of apoptosis, but also has a survival activity, as it is required for embryonic development1, T-lymphocyte activation2, and resistance to necrosis induced by tumour necrosis factor-α (TNF-α) and related family ligands3,4. Here we show that development of caspase-8-deficient mice is completely rescued by ablation of receptor interacting protein kinase-3 (RIPK3). Adult animals lacking both caspase-8 and RIPK3 display a progressive lymphoaccumulative disease resembling that seen with defects in CD95 or CD95-ligand (also known as FAS and FASLG, respectively), and resist the lethal effects of CD95 ligation in vivo. We have found that caspase-8 prevents RIPK3-dependent necrosis without inducing apoptosis by functioning in a proteolytically active complex with FLICE-like inhibitory protein long (FLIPL, also known as CFLAR), and this complex is required for the protective function.

The assembly of the CD-95 (Fas/Apo-1) receptor death-inducing signaling complex occurs in a hierarchical manner; the death domain of CD-95 binds to the corresponding domain in the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD) Mort-1, which in turn recruits the zymogen form of the death protease caspase-8 (FLICE/Mach-1) by a homophilic interaction involving the death effector domains. Immediately after recruitment, the single polypeptide FLICE zymogen is proteolytically processed to the active dimeric species composed of large and small catalytic subunits. Since all caspases cleave their substrates after Asp residues and are themselves processed from the single-chain zymogen to the two-chain active enzyme by cleavage at internal Asp residues, it follows that an upstream caspase can process a downstream zymogen. However, since FLICE represents the most apical caspase in the Fas pathway, its mode of activation has been enigmatic. We hypothesized that the FLICE zymogen possesses intrinsic enzymatic activity such that when approximated, it autoprocesses to the active protease. Support for this was provided by (i) the synthesis of chimeric Fpk3FLICE molecules that can be oligomerizedin vivo by the synthetic cell-permeable dimerizer FK1012H2. Cells transfected with Fpk3FLICE underwent apoptosis after exposure to FK1012H2; (ii) the creation of a nonprocessable zymogen form of FLICE that retained low but detectable protease activity. The assembly of the CD-95 (Fas/Apo-1) receptor death-inducing signaling complex occurs in a hierarchical manner; the death domain of CD-95 binds to the corresponding domain in the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD) Mort-1, which in turn recruits the zymogen form of the death protease caspase-8 (FLICE/Mach-1) by a homophilic interaction involving the death effector domains. Immediately after recruitment, the single polypeptide FLICE zymogen is proteolytically processed to the active dimeric species composed of large and small catalytic subunits. Since all caspases cleave their substrates after Asp residues and are themselves processed from the single-chain zymogen to the two-chain active enzyme by cleavage at internal Asp residues, it follows that an upstream caspase can process a downstream zymogen. However, since FLICE represents the most apical caspase in the Fas pathway, its mode of activation has been enigmatic. We hypothesized that the FLICE zymogen possesses intrinsic enzymatic activity such that when approximated, it autoprocesses to the active protease. Support for this was provided by (i) the synthesis of chimeric Fpk3FLICE molecules that can be oligomerizedin vivo by the synthetic cell-permeable dimerizer FK1012H2. Cells transfected with Fpk3FLICE underwent apoptosis after exposure to FK1012H2; (ii) the creation of a nonprocessable zymogen form of FLICE that retained low but detectable protease activity. Apoptosis, or programmed cell death, is a cell deletion mechanism that is critical to metazoan survival (1Steller H. Science. 1995; 267: 1445-1449Crossref PubMed Scopus (2445) Google Scholar, 2Raff M.C. Nature. 1992; 356: 397-400Crossref PubMed Scopus (2507) Google Scholar). The cell death machinery is conserved throughout evolution and is composed of several distinct parts including effectors, inhibitors, and activators (1Steller H. Science. 1995; 267: 1445-1449Crossref PubMed Scopus (2445) Google Scholar, 3Chinnaiyan A. Dixit V. Curr. Biol. 1996; 6: 555-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). Mammalian cysteine proteases (designated caspase for cysteine aspartic acid-specific protease) related to the Caenorhabditis elegans cell death gene CED-3 represent the effector components of the apoptotic machinery participating in a regulated proteolytic cascade (4Martin S. Green D. Cell. 1995; 82: 349-352Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1266) Google Scholar, 5Henkart P. Immunity. 1996; 4: 195-201Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (417) Google Scholar). Since all caspases cleave their substrates after Asp residues and are themselves processed from the single-chain zymogen to the two-chain active enzyme by cleavage at internal Asp residues, it follows that an upstream caspase can process a downstream zymogen (6Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (313) Google Scholar, 7Orth K. O'Rourke K. Salvesen G. Dixit V. J. Biol. Chem. 1996; 271: 20977-20980Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (187) Google Scholar, 8Srinivasula S. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar). The assembly of the Fas receptor death-inducing signaling complex occurs in a hierarchical manner; the death domain of CD-95 binds to the corresponding domain in the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD) Mort-1, which in turn recruits the zymogen form of the death protease caspase-8 (FLICE/Mach-1) by a homophilic interaction involving the death effector domains (9Chinnaiyan A. O'Rourke K. Tewari M. Dixit V. Cell. 1995; 81: 505-512Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2189) Google Scholar, 10Boldin M. Varfolomeev E. Pancer Z. Mett I. Camonis J. Wallach D. J. Biol. Chem. 1995; 270: 7795-7798Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (945) Google Scholar, 11Boldin M. Goncharov T. Goltsev Y. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2124) Google Scholar, 12Muzio M. Chinnaiyan A. Kischkel F. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P. Peter M. Dixit V. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2760) Google Scholar). Immediately after recruitment, the single polypeptide FLICE zymogen is proteolytically processed to the active dimeric species composed of large and small catalytic subunits that amplify the apoptotic signal by activating other downstream caspases (6Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (313) Google Scholar, 8Srinivasula S. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar, 13Medema J. Scaffidi C. Kischkel F.C. Shevchenko A. Mann M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1997; 16: 2794-2804Crossref PubMed Scopus (1045) Google Scholar). However, since FLICE represents the most apical caspase in the Fas pathway, its mode of activation has been enigmatic. We hypothesized that the FLICE zymogen possesses intrinsic enzymatic activity such that when approximated, it autoprocesses to the active protease. Support for this model was provided by two independent approaches: (i) the synthesis of chimeric Fpk3FLICE molecules that can be oligomerized in vivo by the synthetic cell-permeable dimerizer FK1012H2. Cells transfected with Fpk3FLICE underwent apoptosis after exposure to FK1012H2; (ii) the creation of a nonprocessable zymogen form of FLICE that retained low but detectable protease activity. MFpk3Eu vector containing a myristoylation site, three copies of Fpk in tandem and a hemagglutinin epitope tag (HA) was originally made by D. Spencer (Baylor College of Medicine). Fpk is a double mutant of FKBP12 where residues 89 and 90 have been mutated from GI to PK (14Spencer D. Wandless T. Schreiber S. Crabtree G. Science. 1993; 262: 1019-1024Crossref PubMed Scopus (712) Google Scholar). The catalytic domain of FLICE (encoding Ser-217 to Asp-479) was obtained by polymerase chain reaction and sub-cloned in-frame between the last Fpk and the epitope tag at the SalI site in MFpk3Eu. The same catalytic domain of a mutant version of FLICE, in which Cys-360 was replaced by Ser, was similarly cloned. For production of recombinant purified proteins, the catalytic domain of FLICE or mutant versions of FLICE in which the catalytic Cys-360 was replaced by Ser and/or the cleavage sites Asp-374 and Asp-384 were replaced by Ala, were obtained by polymerase chain reaction and sub-cloned into the pET15b expression vector (Novagen). The proteins were expressed in the BL21 pLysS Escherichia coli strain and purified using the QIAexpress Kit (Qiagen) following the manufacturer's instructions. Human embryonic kidney 293 and HeLa cells were cultured as described previously. Cell death assays were performed as described (9Chinnaiyan A. O'Rourke K. Tewari M. Dixit V. Cell. 1995; 81: 505-512Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2189) Google Scholar). Hela cells were transfected using the lipofectAMINE procedure (Life Technologies, Inc.) according to the manufacturer's instructions. 293 cells were transfected using calcium phosphate precipitation. For immunoblotting analysis, cells (5 × 105) were lysed in 50 μl of buffer (50 mm KCl, 50 mm HEPES, 5 mm EGTA, 2 mm MgCl2, protease inhibitor mixture) followed by three cycles of freeze thaw. The membrane-rich fraction was pelleted, resuspended in 8 murea and, after boiling in sample buffer, resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose membrane, and probed with anti-HA antibody. For coimmunoprecipitation analysis, cells (2 × 106) were lysed in 1 ml of buffer (1% Nonidet P-40, 150 mm NaCl, 50 mmTris, 20 mm HEPES, protease inhibitor mixture) and incubated either with anti-HA 1The abbreviations used are: HA, hemagglutinin; PIPES, 1,4-piperazinediethanesulfonic acid; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid; BIO-DEVD-AMK, N-(biotinyl-Asp-Glu-Val-Asp-[(2,6-dimethylbenzoyl)oxy]methyl ketone; -CMK, chloromethyl ketone; -FMK, fluoromethyl ketone; -AFC, 7-amino-4-trifluoromethyl coumarin; Z-, carbobenoxy. antibodies or anti-FLICE (small subunit-specific) rabbit antiserum. Immune complexes were precipitated by the addition of protein G-Sepharose (Sigma). After extensive washing, the Sepharose beads were boiled in sample buffer, and the eluted proteins were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting with anti-HA antibody. The enzymatic reaction was carried out at 37 °C in 20 mmPIPES, 0.1 mm substrate, 100 mm NaCl, 10 mm dithiothreitol (fresh), 1 mm EDTA, 0.1% CHAPS, and 10% sucrose, pH 7.2. The initial rates of hydrolysis were measured by release of AFC (7-amino-4-methyl cou marin) from the substrate by the enzymes at appropriate emission and excitation wavelengths using a Perkin-Elmer LS50B fluorimeter equipped with a thermostated plate reader. Titrations of wild type and FLICE-DD [arrow] AA were carried out by preincubating the enzyme with varying concentrations of Z-DEVD-FMK or CrmA in assay buffer for 30 min at room temperature. The inhibitor was added at concentrations spanning from 0 to significantly above the concentration of active enzyme. After the preincubation, Z-DEVD-AFC was added in assay buffer to a final substrate concentration of 0.1 mm. The relative amount of uninhibited enzyme was evaluated from the initial rates of hydrolysis of the substrate as described above, and the concentration of active enzyme was calculated by extrapolating data points to their intersection with the x axis. The caspase-8 concentration used in the titration assays were 0.2 micromolar for the native enzyme and 20 micromolar for the DD → AA mutant. 100 ng of purified proteins were incubated with or without N-(biotinyl-Asp-Glu-Val-Asp-[(2,6-dimethylbenzoyl)oxy]methyl ketone (BIO-DEVD-AMK) (15Clayton L. Ghendler Y. Mizoguchi E. Patch R. Ocain T. Orth K. Bhan A. Dixit V. Reinherz E. EMBO J. 1997; 16: 2282-2293Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar) at a concentration of 0.5 μm in a final volume of 50 μl of buffer (0.1% CHAPS, 10 mmdithiothreitol, 10 mm Tris, pH 7.5) for 15 min at 25 °C. For competition experiments, increasing amounts of a nonbiotinylated version of the DEVD tetrapeptide (DEVD-CMK; Bachem) were added to the reaction. Samples were boiled in sample buffer in the absence of reductant, resolved by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under nonreducing conditions, blotted onto nitrocellulose, blocked in phosphate-buffered saline containing 3% bovine serum albumin and 0.1% Tween 20, incubated with streptavidin-conjugated horseradish peroxidase (ICN) in phosphate-buffered saline, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Tween, washed with 50 mm Tris, pH 7.5, 0.25% gelatin, 0.05% Tween 20, 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, and developed by ECL. Alternatively, the membrane was analyzed by immunoblotting with anti-FLICE antiserum specific for the small catalytic subunit. To determine if FLICE oligomerization in vivo could result in activation, chimeric FpkFLICE expression constructs were engineered. Fpk (molecular mass 12 kDa), a double mutant of FKBP (FK binding protein FK506) (16Yang D. Rosen M.K. Schreiber S.L. J. Am. Chem. Soc. 1993; 115: 819-820Crossref Scopus (104) Google Scholar) contains a single binding site for the cell-permeable immunosuppressive drug FK506. The FKBP-FK506 complex is a potent inhibitor of calcineurin, a protein phosphatase that plays a key role in signaling. An FK506 dimer (FK1012H2) was previously synthesized by introducing a cross-linker into the domain of FK506 necessary for inhibition of calcineurin. FK1012H2, although unable to bind calcineurin, still retains its ability to bind and dimerize Fpk polypeptides given its bivalent nature (17Hofmann K. Tschopp J. FEBS Lett. 1995; 371: 321Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 18Rothe M. Sarma V. Dixit V.M. Goeddel D.V. Science. 1995; 269: 1424-1427Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar, 19Heguy A. Baldari C. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) (Fig. 1 a). To mimic recruitment of FLICE to its receptor signaling complex (11Boldin M. Goncharov T. Goltsev Y. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2124) Google Scholar,12Muzio M. Chinnaiyan A. Kischkel F. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P. Peter M. Dixit V. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2760) Google Scholar), the prodomain of FLICE was substituted with a myristoylation signal followed by three tandem repeats of Fpk,(MFpk3FLICE). A catalytically inactive version was constructed by mutating the active-site Cys-360 to Ser (MFpk3FLICE(C → S)). An additional control was the construct MFpk3Eu that encoded only the myristoylation signal, three Fpk repeats in tandem, and an HA epitope tag (Fig. 1 b). To confirm the ability of FK1012H2 to induce oligomerization of Fpk3-containing proteins, human 293 cells were transiently transfected with the MFpk3Eu construct and the catalytically inactive chimera MFpk3FLICE(C → S). The MFpk3FLICE immunoprecipitates contained associating MFpk3Eu only in the presence of FK1012H2 (Fig. 1 c), confirming the validity of the dimerization approach. Ectopic expression of the catalytically active chimera MFpk3FLICE resulted in the production of a protein of predicted molecular mass (69 kDa) that was membrane-associated. The addition of the synthetic ligand FK1012H2 induced rapid disappearance of the catalytically competent MFpk3FLICE chimera. Emergence of the active subunits, however, was not detectable under these experimental conditions. As predicted, the catalytically inactive derivative was efficiently expressed, but on exposure to FK1012H2, did not undergo processing even after prolonged incubation (Fig. 2 a). We next observed if MFpk3FLICE oligomerization resulted in the expected apoptotic demise of transfected cells. Human 293 and HeLa cells were transiently transfected with MFpk3FLICE(C → S) or MFpk3FLICE expression constructs together with a reporter plasmid encoding β-galactosidase. Thirty six h after transfection, cells were left untreated or treated with 250 nm FK1012H2, stained, and analyzed by phase contrast microscopy. As shown in Fig. 2 b, oligomerization of MFpk3FLICE but not MFpk3FLICE(C → S) induced phenotypic alterations characteristic of apoptosis. Cells shrank, displayed membrane blebbing, and detached from the dish. Additionally, the apoptotic substrate poly(ADP-ribose) polymerase was cleaved to its signature 85-kDa form, and genomic DNA was cleaved into characteristic internucleosomal size fragments (data not shown), both biochemical hallmarks of apoptosis. Significantly, treatment of Fpk or Fpk-FLICE(C → S)-transfected cells with higher doses of FK1012H2 for an extended period of time did not induce apoptosis (16Yang D. Rosen M.K. Schreiber S.L. J. Am. Chem. Soc. 1993; 115: 819-820Crossref Scopus (104) Google Scholar, 17Hofmann K. Tschopp J. FEBS Lett. 1995; 371: 321Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 19Heguy A. Baldari C. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 20Spencer D. Belshaw P. Chen L. Ho S. Randazzo F. Crabtree G. Schreiber S. Curr. Biol. 1996; 6: 839-847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (124) Google Scholar) (data not shown). After 3 h of exposure to the synthetic ligand, 50–80% MFpk3FLICE-transfected cells started blebbing, condensing, and detaching from the dish. This was completely abrogated by the broad-spectrum caspase inhibitor Z-VAD-FMK that has previously been shown to inhibit FLICE-induced apoptosis (Fig. 2, c and d) (12Muzio M. Chinnaiyan A. Kischkel F. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P. Peter M. Dixit V. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2760) Google Scholar). Importantly, the monomeric form of the ligand, FK506M, did not induce apoptosis, confirming that the results observed were oligomerization-dependent (Fig. 2, c and d). These data demonstrate that specific clustering of FLICE zymogen causes apoptosis through caspase activation. We hypothesized that this activation occurs through self-processing of the clustered FLICE due to an intrinsic proteolytic activity of the zymogen. To further address this hypothesis, different recombinant versions of FLICE were generated (Fig. 3 a); as shown previously (6Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (313) Google Scholar, 8Srinivasula S. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (484) Google Scholar, 11Boldin M. Goncharov T. Goltsev Y. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2124) Google Scholar), overexpression of catalytically competent FLICE constructs in E. coli generated an active heterodimeric enzyme composed of large and small catalytic subunits. Enzymatically inactive FLICE (catalytic Cys-360 mutated to Ser; FLICE(C → S)) did not undergo processing, consistent with a requirement for intrinsic enzymatic activity. Importantly, an altered form of FLICE that retained the catalytic cysteine but was mutated at the internal cleavage sites (Asp-374 and Asp-384; FLICE(DD → AA)) also did not undergo auto-processing and was expressed as a single polypeptide zymogen as confirmed by protein staining and anti-FLICE immunoblot analysis (data not shown and Fig. 3 c). The processing mutant FLICE in which the catalytic cysteine was additionally inactivated (FLICE (DDCAAS)) was also expressed as a single polypeptide zymogen. These recombinant forms of FLICE were used to establish whether the zymogen did indeed possess enzymatic activity. The activity of the cleavage site mutant version FLICE(DD → AA) was determined by its ability to hydrolyze the tetrapeptide caspase substrate Z-DEVD-AFC (21Nicholson D. All A. Thornberry N.A. Vaillancourt J.P. Ding C.K. Gallant M. Gareau Y. Griffin P.R. Labelle M. Lazebnik Y.A. Munday N.A. Raju S.M. Smulson M.E. Yamin T. Yu V.L. Miller D.K. Nature. 1995; 376: 37-43Crossref PubMed Scopus (3840) Google Scholar), and the portion of active material was determined by titration with the protein inhibitor CrmA (22Zhou Q. Snipas S. Orth K. Muzio M. Dixit V.M. Salvesen G.S. J. Biol. Chem. 1997; 272: 7797-7800Crossref PubMed Scopus (490) Google Scholar, 23Ray C. Black R.A. Kronheim S.R. Greenstreet T.A. Sleath P.R. Salvesen G.S. Pickup D.J. Cell. 1992; 69: 597-604Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (929) Google Scholar) and the covalent peptide based inhibitor, Z-DEVD-FMK (21Nicholson D. All A. Thornberry N.A. Vaillancourt J.P. Ding C.K. Gallant M. Gareau Y. Griffin P.R. Labelle M. Lazebnik Y.A. Munday N.A. Raju S.M. Smulson M.E. Yamin T. Yu V.L. Miller D.K. Nature. 1995; 376: 37-43Crossref PubMed Scopus (3840) Google Scholar). A 100-fold more FLICE(DD → AA) was required on a protein basis to give the same rates of substrate hydrolysis as wild type FLICE (Fig. 3 b). Thus, from these results it is apparent that the bacterially expressed FLICE(DD → AA) mutant equivalent to the zymogen form has approximately 1% of the activity of the wild type enzyme. As expected, the catalytic mutant FLICE(C → S) possessed no enzymatic activity (data not shown). To interpret the enzymatic analysis, we tested the ability of the different versions of FLICE to bind the biotinylated irreversible inhibitor BIO-DEVD-AMK, which covalently binds to the active-site cysteine (15Clayton L. Ghendler Y. Mizoguchi E. Patch R. Ocain T. Orth K. Bhan A. Dixit V. Reinherz E. EMBO J. 1997; 16: 2282-2293Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). As expected, the large subunit of processed native FLICE that contains the catalytic cysteine bound BIO-DEVD-AMK (Fig. 3 c). Additionally, the unprocessed cleavage site mutant (FLICE(DD → AA)) also bound BIO-DEVD-AMK, indicating that the 1% activity resides in the single chain. FLICE(DDC → AAS), as anticipated, did not show any specific binding to BIO-DEVD-AMK. The specificity of the bands indicated was confirmed by competing the binding with a nonbiotinylated version of the DEVD tetrapeptide (Fig. 3 d). Taken together, these data are consistent with a model wherein FLICE zymogen possesses intrinsic low level caspase activity that upon approximation mediated by the adapter molecule Fas-associated death domain (FADD) attains a sufficient concentration to activate the apoptosis pathway. This study provides a remarkably simple solution to the chicken and egg conundrum of how the initiating caspase (FLICE) is proteolytically processed. We are grateful to S. L. Schreiber for helpful suggestions and discussions. We thank David Spencer for MFpk3Eu, Linda Clayton for BIO-DEVD, Ian Jones for his expertise in preparing the figures, and the following members of the Dixit lab for encouragement and discussions: Divya Chaudhary, Arul Chinnaiyan, Hangjun Duan, Shimin Hu, Eric Humke, Justin McCarthy, Karen O'Rourke, James Pan, and Claudius Vincenz.

Apoptotic cells were shown recently to discharge the nucleotides ATP and UTP to act as 'find-me' signals for phagocytes that engulf dying cells before they release potentially harmful cellular contents. This paper shows that the release of ATP and UTP is through the plasma membrane channel pannexin 1, which is specifically opened by caspase activity. The discovery of a role for pannexin 1 in phagocyte chemoattraction could have implications for human diseases that arise from defective clearance of dying cells. Apoptotic cells discharge ATP and UTP, which act as 'find-me' signals for phagocytes that in turn engulf dying cells before potentially harmful cellular contents are released. These authors show that the release of ATP and UTP is exclusively by means of the plasma membrane channel pannexin 1, which is opened specifically by caspase activity. Apoptotic cells release ‘find-me’ signals at the earliest stages of death to recruit phagocytes1. The nucleotides ATP and UTP represent one class of find-me signals2, but their mechanism of release is not known. Here, we identify the plasma membrane channel pannexin 1 (PANX1) as a mediator of find-me signal/nucleotide release from apoptotic cells. Pharmacological inhibition and siRNA-mediated knockdown of PANX1 led to decreased nucleotide release and monocyte recruitment by apoptotic cells. Conversely, PANX1 overexpression enhanced nucleotide release from apoptotic cells and phagocyte recruitment. Patch-clamp recordings showed that PANX1 was basally inactive, and that induction of PANX1 currents occurred only during apoptosis. Mechanistically, PANX1 itself was a target of effector caspases (caspases 3 and 7), and a specific caspase-cleavage site within PANX1 was essential for PANX1 function during apoptosis. Expression of truncated PANX1 (at the putative caspase cleavage site) resulted in a constitutively open channel. PANX1 was also important for the ‘selective’ plasma membrane permeability of early apoptotic cells to specific dyes3. Collectively, these data identify PANX1 as a plasma membrane channel mediating the regulated release of find-me signals and selective plasma membrane permeability during apoptosis, and a new mechanism of PANX1 activation by caspases.

Cowpox virus effectively inhibits inflammatory responses against viral infection in the chick embryo. This study demonstrates that one of the viral genes necessary for this inhibition, the crmA gene (a cytokine response modifier gene), encodes a serpin that is a specific inhibitor of the interleukin-1β converting enzyme. This serpin can prevent the proteolytic activation of interleukin-1β, thereby suppressing an interleukin-1β response to infection. However, the modification of this single cytokine response is not sufficient to inhibit inflammatory responses. This suggests that cowpox virus encodes several cytokine response modifiers that act together to inhibit the release of pro-inflammatory cytokines in response to infection. These viral countermeasures to host defenses against infection may contribute significantly to the pathology associated with poxvirus infections.

Abstract

 The molecular mechanism(s) that regulate apoptosis by caspase inhibition remain poorly understood. The main endogenous inhibitors are members of the IAP family and are exemplified by XIAP, which regulates the initiator caspase-9, and the executioner caspases-3 and -7. We report the crystal structure of the second BIR domain of XIAP (BIR2) in complex with caspase-3, at a resolution of 2.7 Å, revealing the structural basis for inhibition. The inhibitor makes limited contacts through its BIR domain to the surface of the enzyme, and most contacts to caspase-3 originate from the N-terminal extension. This lies across the substrate binding cleft, but in reverse orientation compared to substrate binding. The mechanism of inhibition is due to a steric blockade prohibitive of substrate binding, and is distinct from the mechanism utilized by synthetic substrate analog inhibitors.

The apoptotic signal triggered by ligation of members of the death receptor family is promoted by sequential activation of caspase zymogens. We show here that in a purified system, the initiator caspases-8 and -10 directly process the executioner pro-caspase-3 with activation rates (k cat/K m) of 8.7 × 105 and 2.8 × 105m−1 s−1, respectively. These rates are of sufficient magnitude to indicate direct processingin vivo. Differentially processed forms of caspase-3 that accumulate during its activation have similar rates of activation, activities, and specificities. The pattern and rate of caspase-8 induced activation of pro-caspase-3 in cytosolic extracts was the same as in a purified system. Moreover, immunodepletion of a putative intermediary in the pathway to activation, pro-caspase-9, was without consequence. Taken together these data demonstrate that the initiator caspase-8 can directly activate pro-caspase-3 without the requirement for an accelerator. The in vitro data thus help to deconvolute previous in vivo transfection studies which have debated the role of a direct versus indirect transmission of the apoptotic signal generated by ligation of death receptors. The apoptotic signal triggered by ligation of members of the death receptor family is promoted by sequential activation of caspase zymogens. We show here that in a purified system, the initiator caspases-8 and -10 directly process the executioner pro-caspase-3 with activation rates (k cat/K m) of 8.7 × 105 and 2.8 × 105m−1 s−1, respectively. These rates are of sufficient magnitude to indicate direct processingin vivo. Differentially processed forms of caspase-3 that accumulate during its activation have similar rates of activation, activities, and specificities. The pattern and rate of caspase-8 induced activation of pro-caspase-3 in cytosolic extracts was the same as in a purified system. Moreover, immunodepletion of a putative intermediary in the pathway to activation, pro-caspase-9, was without consequence. Taken together these data demonstrate that the initiator caspase-8 can directly activate pro-caspase-3 without the requirement for an accelerator. The in vitro data thus help to deconvolute previous in vivo transfection studies which have debated the role of a direct versus indirect transmission of the apoptotic signal generated by ligation of death receptors. tumor necrosis factor receptor 1 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate 7-amino-4-trifluoromethyl coumarin p-nitroanilide polyacrylamide gel electrophoresis bovine poly(ADP-ribose)polymerase tumor necrosis factor carbobenzoxy-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin carbobenzoxy-Ile-Glu-Thr-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin acetyl 1,4-piperazinediethanesulfonic acid polymerase chain reaction. Regulation of apoptosis is vital to the development and long term survival of metazoan animals. Apoptosis is required to maintain the balance between cell proliferation and cell death and, therefore, disruptions in the apoptotic program are associated with pathologies such as cancer, where there is too little cell death, and degenerative diseases, where there is too much cell death. Apoptosis can be initiated by at least three types of signals: (i) specific ligation of members on the tumor necrosis factor receptor (TNFR-1)1family, which includes Fas/Apo-1/CD95; (ii) cellular stress, which includes genotoxic damage and anti-neoplastic drugs; and (iii) delivery of granule-associated serine proteases from cytotoxic lymphocytes into target cells. Key mediators that initiate and execute the apoptotic program are members of the caspase family of cysteine proteases whose activation is believed to be essential for virtually all forms of apoptosis (1Salvesen G.S. Dixit V.M. Cell. 1997; 91: 443-446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1932) Google Scholar, 2Cohen G.M. Biochem. J. 1997; 326: 1-16Crossref PubMed Scopus (4105) Google Scholar, 3Nicholson D.W. Thornberry N.A. Trends Biochem. Sci. 1997; 22: 299-306Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2176) Google Scholar). Caspases-3, -6, and -7 are involved in the execution of cells in response to many apoptotic stimuli including ligation of death receptors of the TNFR-1 receptor family, resulting in cleavage of a number of proteins whose limited proteolysis is definitive of apoptosis. However, these executioner caspases are not directly activated by receptor ligation, but rely on the proteolytic activity of upstream initiator caspases-8 and -10 (4Muzio M. Chinnaiyan A.M. Kischkel F.C. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J.D. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P.H. Peter M.E. Dixit V.M. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2723) Google Scholar, 5Boldin M.P. Goncharov T.M. Goltsev Y.V. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2100) Google Scholar, 6Srinivasula S.M. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (480) Google Scholar). In the case of caspase-8 the activation occurs by recruitment of the zymogen to the cytosolic face of the death receptor, such that the initial proteolytic signal originates by autoprocessing of the clustered zymogen (7Muzio M. Stockwell B.R. Stennicke H.R. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 2926-2930Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (882) Google Scholar, 8Yang X. Chang H.Y. Baltimore D. Mol Cell. 1998; 1: 319-325Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (368) Google Scholar).At the execution phase, caspase-3 seems to be upstream of caspases-6 and -7 and, therefore, its activation represents a key point in transmission of the proteolytic signal (9Hirata H. Takahashi A. Kobayashi S. Yonehara S. Sawai H. Okazaki T. Yamamoto K. Sasada M. J. Exp. Med. 1998; 187: 587-600Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar). However, the exact mechanism of how the death signal is conveyed from caspase-8 to caspase-3 remains unresolved. Is the apoptotic signal transmitted by direct activation of the executioners by the initiators, thus constituting a minimal two-step cascade that serves to mediate the apoptotic signals, or is the signal further amplified by the presence of additional factors as suggested by Scaffidi et al.(10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar).To address these issues we have performed a detailed kinetic study of the activation of pro-caspase-3 by caspases-8 and -10 using recombinant zymogens and active proteases in a defined system, and compared this to the activation of the zymogen by caspases-8 and -10 in cytosolic extracts. This allows us to predict the sequence of events that results in transmission of the proteolytic death signal originating from the initiator caspases to the executioners, and on the basis of in vitro observations, test the hypothesis that additional amplifiers and regulators of the apoptotic signals are required in vivo.DISCUSSIONCaspases are commonly divided into apical and executioner subsets (1Salvesen G.S. Dixit V.M. Cell. 1997; 91: 443-446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1932) Google Scholar, 33Chinnaiyan A.M. Dixit V.M. Curr. Biol. 1996; 6: 555-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). There exist two well characterized points at which apical caspases initiate apoptotic signals. One is at the cell surface where members of the TNFR-1 family of death receptors transmit a signal across the cell membrane following receptor clustering. The second point of initiation follows the release of mitochondrial factors (34Liu X. Kim C.N. Yang J. Jemmerson R. Wang X. Cell. 1996; 86: 147-157Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4433) Google Scholar,35Kroemer G. Zamzami N. Susin S.A. Immunol. Today. 1997; 18: 44-51Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1379) Google Scholar), and although this post-mitochondrial pathway is well documented it is unclear how the mitochondrion perceives the apoptotic signal. Nevertheless, anti-neoplastic drugs, genotoxic damage, and inhibition of cellular signal transduction pathways all seem to converge on the mitochondrial route (36Reed J.C. Cell. 1997; 91: 559-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (694) Google Scholar). At each point of initiation the first recognizable biochemical event is specific caspase activation, and each initiation point utilizes distinct caspases. In the death receptor pathway(s) the apical caspase-8 (and possibly 10) transmits a proteolytic signal following autoactivation at the cytosolic face of the receptor (4Muzio M. Chinnaiyan A.M. Kischkel F.C. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J.D. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P.H. Peter M.E. Dixit V.M. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2723) Google Scholar, 5Boldin M.P. Goncharov T.M. Goltsev Y.V. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2100) Google Scholar, 6Srinivasula S.M. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (480) Google Scholar, 37Fernandes-Alnemri T. Armstrong R. Krebs J. Srinivasula S.M. Wang L. Bullrich F. Fritz L. Trapani J.A. Croce C.M. Tomaselli K.J. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 7464-7469Crossref PubMed Scopus (692) Google Scholar, 38Vincenz C. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 6578-6583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (238) Google Scholar). The signal for activation appears to be local clustering of pro-caspase-8 that possesses enough activity in its zymogen to achieve autolytic proteolytic maturation (7Muzio M. Stockwell B.R. Stennicke H.R. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 2926-2930Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (882) Google Scholar, 8Yang X. Chang H.Y. Baltimore D. Mol Cell. 1998; 1: 319-325Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (368) Google Scholar, 39Martin D.A. Siegel R.M. Zheng L. Lenardo M.J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 4345-4349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (329) Google Scholar). In the mitochondrial route specific or nonspecific delivery of cytochromec (29Li P. Nijhawan D. Budihardjo I. Srinivasula S.M. Ahmad M. Alnemri E.S. Wang X. Cell. 1997; 91: 479-489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6183) Google Scholar, 40Zamzami N. Susin S.A. Marchetti P. Hirsch T. Gomez-Monterrey I.M.C. Kroemer G. J. Exp. Med. 1996; 183: 1533-1544Crossref PubMed Scopus (1262) Google Scholar, 41Kluck R.M. Bossy-Wetzel E. Green D.R. Newmeyer D.D. Science. 1997; 275: 1132-1136Crossref PubMed Scopus (4254) Google Scholar, 42Zou H. Henzel W.J. Liu X. Lutschg A. Wang X. Cell. 1997; 90: 405-413Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2727) Google Scholar) to the protein Apaf-1 results in recruitment and activation of caspase-9 (29Li P. Nijhawan D. Budihardjo I. Srinivasula S.M. Ahmad M. Alnemri E.S. Wang X. Cell. 1997; 91: 479-489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6183) Google Scholar). Both caspase-8 and caspase-9 have been demonstrated to act on in vitro translated pro-caspases-3 and -7, the executioner caspases whose activation correlates with apoptosis. Thus there are two potential routes to activate the executioner caspases, and in this context both caspases-8 and -9 can be thought of as initiators whose pathways converge at the execution phase of apoptosis.Although caspases-8 and -10 can activate pro-caspase-3 in vitro, it has proven difficult to determine whether the apical caspases perform this function directly or indirectly, because previous studies have relied on in vitro translated zymogens or cytosolic extracts (6Srinivasula S.M. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (480) Google Scholar, 31Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (312) Google Scholar, 37Fernandes-Alnemri T. Armstrong R. Krebs J. Srinivasula S.M. Wang L. Bullrich F. Fritz L. Trapani J.A. Croce C.M. Tomaselli K.J. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 7464-7469Crossref PubMed Scopus (692) Google Scholar, 43Orth K. Chinnaiyan A.M. Garg M. Froelich C.J. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 16443-16446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (374) Google Scholar). We here demonstrate that caspase-8 and -10 can rapidly activate caspase-3. More importantly, focusing on caspase-8 we observe that activation proceeds with the same rate in a 293 cytosolic extract, eliminating a requirement for an intermediary component. Additionally, depletion of pro-caspase-9 from the extract has no impact on caspase activation by caspase-8, and MCF-7 cells deficient in caspase-3 failed to support processing of pro-caspase-9. Therefore, processing of pro-caspase-9 in death receptor-mediated apoptosis requires the presence and activation of caspase-3 which makes it a downstream event unlikely to play a major role in caspase activation.It has been proposed that mitochondria are required to transmit the apoptotic signal generated by treatment of cells by agonistic Fas antibodies, but only in a small selection of cell lines (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar). This would imply that caspase-8, the apical caspase of the Fas pathway, initiates a mitochondrial signal. In support of this, the generation of caspase activity initiated by addition of human caspase-8 to cytosolic extracts of Xenopus eggs is accelerated in the presence of mitochondria (44Kuwana T. Smith J.J. Muzio M. Dixit V. Newmeyer D.D. Kornbluth S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16589-16594Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). However, the relevance of this to homologous systems is unclear, since it is not known whether Xenopus has a caspase-8, and the kinetics of activation of a putativeXenopus caspase-3 ortholog, or whether the caspase activity in Xenopus extracts is due to such an ortholog, have not been determined. The data presented above, in contrast, do not suggest any requirement for an intermediary between caspase-8 and caspase-3. Therefore, the question is whether the mitochondrial acceleration occurs in vivo, and whether caspase-8 must transmit its signal via mitochondria to the executioners in vivo. Currently the most valuable evidence for a role of mitochondria in apoptosis triggered by death receptor ligation comes from several studies investigating expression of ectopic or transgenic Bcl-2, which is hypothesized to operate by blocking mitochondrial-dependent apoptosis (reviewed in Ref. 36Reed J.C. Cell. 1997; 91: 559-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (694) Google Scholar). Most investigators agree that Bcl-2 prevents apoptosis triggered by genotoxic damage, glucocorticoids, and chemotherapeutic drugs, but there are inconsistencies in the data describing the protective effect of Bcl-2 against apoptosis induced by death receptors (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar, 33Chinnaiyan A.M. Dixit V.M. Curr. Biol. 1996; 6: 555-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 45Srinivasan A. Li F. Wong A. Kodandapani L. Smidt Jr., R. Krebs J.F. Fritz L.C. Wu J.C. Tomaselli K.J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 4523-4529Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar, 46Strasser A. Harris A.W. Huang D.C. Krammer P.H. Cory S. EMBO J. 1995; 14: 6136-6147Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). In a survey of several cell lines, Scaffidi et al. (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar) noted that most are not protected by Bcl-2 from apoptosis triggered by agonist Fas antibodies. However, the use of agonist antibodies and immortalized cell lines may not be the best way to determine a role for Bcl-2. More significantly, T-cell apoptosis in vivo, which is dependent on physiologic Fas ligation, is unaffected in Bcl-2 transgenic mice (46Strasser A. Harris A.W. Huang D.C. Krammer P.H. Cory S. EMBO J. 1995; 14: 6136-6147Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). In contrast, death following injection of agonist Fas antibodies in whole mice was significantly retarded in Bcl-2 transgenic mice (47Lacronique V. Mignon A. Fabre M. Viollet B. Rouquet N. Molina T. Porteu A. Henrion A. Bouscary D. Varlet P. Joulin V. Kahn A. Nat. Med. 1996; 2: 80-86Crossref PubMed Scopus (348) Google Scholar). These somewhat contradictory studies can be reconciled if some cells support direct transmission of caspase-8 to caspase-3, while others require a mitochondrial accelerator (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar).Since pro-caspase-9 is not processed by caspase-8, the mitochondrial accelerator must act upstream of the caspase-9 activator complex and, therefore, presumably upstream of the mitochondrion. Possibly the pro-apoptotic mitochondrial signal is activated by the action of caspase-8 on mitochondria, or a latent protein that activates mitochondria for apoptosis. The importance of the mitochondrial route in Fas death is not clear, since evidence suggests that only a minority of cell lines require mitochondria to transmit the caspase-8 signal. If direct transmission of the signal from caspase-8 to the executioner caspase-3 occurs in most cell lines, what is the advantage of a mitochondrial intermediate? Usually, levels of complexity are added to allow additional regulation points, as clearly evidenced by the evolution of the vertebrate blood coagulation cascade. It is not immediately clear what advantage cells would achieve by adding a level of regulation to the Fas-triggered death signal, but future studies will doubtlessly focus on this issue. Regardless, it would appear that those cells in the body that are primed to undergo apoptosis during education of the immune system have evolved death receptors, caspase-8, and the caspase-8 activator complex to allow rapid direct transmission of the death signal, bypassing any mitochondrial requirement, and that pro-caspase-3 is a major physiologic substrate of caspase-8 (Fig. 7). Regulation of apoptosis is vital to the development and long term survival of metazoan animals. Apoptosis is required to maintain the balance between cell proliferation and cell death and, therefore, disruptions in the apoptotic program are associated with pathologies such as cancer, where there is too little cell death, and degenerative diseases, where there is too much cell death. Apoptosis can be initiated by at least three types of signals: (i) specific ligation of members on the tumor necrosis factor receptor (TNFR-1)1family, which includes Fas/Apo-1/CD95; (ii) cellular stress, which includes genotoxic damage and anti-neoplastic drugs; and (iii) delivery of granule-associated serine proteases from cytotoxic lymphocytes into target cells. Key mediators that initiate and execute the apoptotic program are members of the caspase family of cysteine proteases whose activation is believed to be essential for virtually all forms of apoptosis (1Salvesen G.S. Dixit V.M. Cell. 1997; 91: 443-446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1932) Google Scholar, 2Cohen G.M. Biochem. J. 1997; 326: 1-16Crossref PubMed Scopus (4105) Google Scholar, 3Nicholson D.W. Thornberry N.A. Trends Biochem. Sci. 1997; 22: 299-306Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2176) Google Scholar). Caspases-3, -6, and -7 are involved in the execution of cells in response to many apoptotic stimuli including ligation of death receptors of the TNFR-1 receptor family, resulting in cleavage of a number of proteins whose limited proteolysis is definitive of apoptosis. However, these executioner caspases are not directly activated by receptor ligation, but rely on the proteolytic activity of upstream initiator caspases-8 and -10 (4Muzio M. Chinnaiyan A.M. Kischkel F.C. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J.D. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P.H. Peter M.E. Dixit V.M. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2723) Google Scholar, 5Boldin M.P. Goncharov T.M. Goltsev Y.V. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2100) Google Scholar, 6Srinivasula S.M. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (480) Google Scholar). In the case of caspase-8 the activation occurs by recruitment of the zymogen to the cytosolic face of the death receptor, such that the initial proteolytic signal originates by autoprocessing of the clustered zymogen (7Muzio M. Stockwell B.R. Stennicke H.R. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 2926-2930Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (882) Google Scholar, 8Yang X. Chang H.Y. Baltimore D. Mol Cell. 1998; 1: 319-325Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (368) Google Scholar). At the execution phase, caspase-3 seems to be upstream of caspases-6 and -7 and, therefore, its activation represents a key point in transmission of the proteolytic signal (9Hirata H. Takahashi A. Kobayashi S. Yonehara S. Sawai H. Okazaki T. Yamamoto K. Sasada M. J. Exp. Med. 1998; 187: 587-600Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar). However, the exact mechanism of how the death signal is conveyed from caspase-8 to caspase-3 remains unresolved. Is the apoptotic signal transmitted by direct activation of the executioners by the initiators, thus constituting a minimal two-step cascade that serves to mediate the apoptotic signals, or is the signal further amplified by the presence of additional factors as suggested by Scaffidi et al.(10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar). To address these issues we have performed a detailed kinetic study of the activation of pro-caspase-3 by caspases-8 and -10 using recombinant zymogens and active proteases in a defined system, and compared this to the activation of the zymogen by caspases-8 and -10 in cytosolic extracts. This allows us to predict the sequence of events that results in transmission of the proteolytic death signal originating from the initiator caspases to the executioners, and on the basis of in vitro observations, test the hypothesis that additional amplifiers and regulators of the apoptotic signals are required in vivo. DISCUSSIONCaspases are commonly divided into apical and executioner subsets (1Salvesen G.S. Dixit V.M. Cell. 1997; 91: 443-446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1932) Google Scholar, 33Chinnaiyan A.M. Dixit V.M. Curr. Biol. 1996; 6: 555-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). There exist two well characterized points at which apical caspases initiate apoptotic signals. One is at the cell surface where members of the TNFR-1 family of death receptors transmit a signal across the cell membrane following receptor clustering. The second point of initiation follows the release of mitochondrial factors (34Liu X. Kim C.N. Yang J. Jemmerson R. Wang X. Cell. 1996; 86: 147-157Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4433) Google Scholar,35Kroemer G. Zamzami N. Susin S.A. Immunol. Today. 1997; 18: 44-51Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1379) Google Scholar), and although this post-mitochondrial pathway is well documented it is unclear how the mitochondrion perceives the apoptotic signal. Nevertheless, anti-neoplastic drugs, genotoxic damage, and inhibition of cellular signal transduction pathways all seem to converge on the mitochondrial route (36Reed J.C. Cell. 1997; 91: 559-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (694) Google Scholar). At each point of initiation the first recognizable biochemical event is specific caspase activation, and each initiation point utilizes distinct caspases. In the death receptor pathway(s) the apical caspase-8 (and possibly 10) transmits a proteolytic signal following autoactivation at the cytosolic face of the receptor (4Muzio M. Chinnaiyan A.M. Kischkel F.C. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J.D. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P.H. Peter M.E. Dixit V.M. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2723) Google Scholar, 5Boldin M.P. Goncharov T.M. Goltsev Y.V. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2100) Google Scholar, 6Srinivasula S.M. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (480) Google Scholar, 37Fernandes-Alnemri T. Armstrong R. Krebs J. Srinivasula S.M. Wang L. Bullrich F. Fritz L. Trapani J.A. Croce C.M. Tomaselli K.J. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 7464-7469Crossref PubMed Scopus (692) Google Scholar, 38Vincenz C. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 6578-6583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (238) Google Scholar). The signal for activation appears to be local clustering of pro-caspase-8 that possesses enough activity in its zymogen to achieve autolytic proteolytic maturation (7Muzio M. Stockwell B.R. Stennicke H.R. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 2926-2930Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (882) Google Scholar, 8Yang X. Chang H.Y. Baltimore D. Mol Cell. 1998; 1: 319-325Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (368) Google Scholar, 39Martin D.A. Siegel R.M. Zheng L. Lenardo M.J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 4345-4349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (329) Google Scholar). In the mitochondrial route specific or nonspecific delivery of cytochromec (29Li P. Nijhawan D. Budihardjo I. Srinivasula S.M. Ahmad M. Alnemri E.S. Wang X. Cell. 1997; 91: 479-489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6183) Google Scholar, 40Zamzami N. Susin S.A. Marchetti P. Hirsch T. Gomez-Monterrey I.M.C. Kroemer G. J. Exp. Med. 1996; 183: 1533-1544Crossref PubMed Scopus (1262) Google Scholar, 41Kluck R.M. Bossy-Wetzel E. Green D.R. Newmeyer D.D. Science. 1997; 275: 1132-1136Crossref PubMed Scopus (4254) Google Scholar, 42Zou H. Henzel W.J. Liu X. Lutschg A. Wang X. Cell. 1997; 90: 405-413Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2727) Google Scholar) to the protein Apaf-1 results in recruitment and activation of caspase-9 (29Li P. Nijhawan D. Budihardjo I. Srinivasula S.M. Ahmad M. Alnemri E.S. Wang X. Cell. 1997; 91: 479-489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6183) Google Scholar). Both caspase-8 and caspase-9 have been demonstrated to act on in vitro translated pro-caspases-3 and -7, the executioner caspases whose activation correlates with apoptosis. Thus there are two potential routes to activate the executioner caspases, and in this context both caspases-8 and -9 can be thought of as initiators whose pathways converge at the execution phase of apoptosis.Although caspases-8 and -10 can activate pro-caspase-3 in vitro, it has proven difficult to determine whether the apical caspases perform this function directly or indirectly, because previous studies have relied on in vitro translated zymogens or cytosolic extracts (6Srinivasula S.M. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (480) Google Scholar, 31Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (312) Google Scholar, 37Fernandes-Alnemri T. Armstrong R. Krebs J. Srinivasula S.M. Wang L. Bullrich F. Fritz L. Trapani J.A. Croce C.M. Tomaselli K.J. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 7464-7469Crossref PubMed Scopus (692) Google Scholar, 43Orth K. Chinnaiyan A.M. Garg M. Froelich C.J. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 16443-16446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (374) Google Scholar). We here demonstrate that caspase-8 and -10 can rapidly activate caspase-3. More importantly, focusing on caspase-8 we observe that activation proceeds with the same rate in a 293 cytosolic extract, eliminating a requirement for an intermediary component. Additionally, depletion of pro-caspase-9 from the extract has no impact on caspase activation by caspase-8, and MCF-7 cells deficient in caspase-3 failed to support processing of pro-caspase-9. Therefore, processing of pro-caspase-9 in death receptor-mediated apoptosis requires the presence and activation of caspase-3 which makes it a downstream event unlikely to play a major role in caspase activation.It has been proposed that mitochondria are required to transmit the apoptotic signal generated by treatment of cells by agonistic Fas antibodies, but only in a small selection of cell lines (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar). This would imply that caspase-8, the apical caspase of the Fas pathway, initiates a mitochondrial signal. In support of this, the generation of caspase activity initiated by addition of human caspase-8 to cytosolic extracts of Xenopus eggs is accelerated in the presence of mitochondria (44Kuwana T. Smith J.J. Muzio M. Dixit V. Newmeyer D.D. Kornbluth S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16589-16594Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). However, the relevance of this to homologous systems is unclear, since it is not known whether Xenopus has a caspase-8, and the kinetics of activation of a putativeXenopus caspase-3 ortholog, or whether the caspase activity in Xenopus extracts is due to such an ortholog, have not been determined. The data presented above, in contrast, do not suggest any requirement for an intermediary between caspase-8 and caspase-3. Therefore, the question is whether the mitochondrial acceleration occurs in vivo, and whether caspase-8 must transmit its signal via mitochondria to the executioners in vivo. Currently the most valuable evidence for a role of mitochondria in apoptosis triggered by death receptor ligation comes from several studies investigating expression of ectopic or transgenic Bcl-2, which is hypothesized to operate by blocking mitochondrial-dependent apoptosis (reviewed in Ref. 36Reed J.C. Cell. 1997; 91: 559-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (694) Google Scholar). Most investigators agree that Bcl-2 prevents apoptosis triggered by genotoxic damage, glucocorticoids, and chemotherapeutic drugs, but there are inconsistencies in the data describing the protective effect of Bcl-2 against apoptosis induced by death receptors (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar, 33Chinnaiyan A.M. Dixit V.M. Curr. Biol. 1996; 6: 555-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 45Srinivasan A. Li F. Wong A. Kodandapani L. Smidt Jr., R. Krebs J.F. Fritz L.C. Wu J.C. Tomaselli K.J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 4523-4529Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar, 46Strasser A. Harris A.W. Huang D.C. Krammer P.H. Cory S. EMBO J. 1995; 14: 6136-6147Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). In a survey of several cell lines, Scaffidi et al. (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar) noted that most are not protected by Bcl-2 from apoptosis triggered by agonist Fas antibodies. However, the use of agonist antibodies and immortalized cell lines may not be the best way to determine a role for Bcl-2. More significantly, T-cell apoptosis in vivo, which is dependent on physiologic Fas ligation, is unaffected in Bcl-2 transgenic mice (46Strasser A. Harris A.W. Huang D.C. Krammer P.H. Cory S. EMBO J. 1995; 14: 6136-6147Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). In contrast, death following injection of agonist Fas antibodies in whole mice was significantly retarded in Bcl-2 transgenic mice (47Lacronique V. Mignon A. Fabre M. Viollet B. Rouquet N. Molina T. Porteu A. Henrion A. Bouscary D. Varlet P. Joulin V. Kahn A. Nat. Med. 1996; 2: 80-86Crossref PubMed Scopus (348) Google Scholar). These somewhat contradictory studies can be reconciled if some cells support direct transmission of caspase-8 to caspase-3, while others require a mitochondrial accelerator (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar).Since pro-caspase-9 is not processed by caspase-8, the mitochondrial accelerator must act upstream of the caspase-9 activator complex and, therefore, presumably upstream of the mitochondrion. Possibly the pro-apoptotic mitochondrial signal is activated by the action of caspase-8 on mitochondria, or a latent protein that activates mitochondria for apoptosis. The importance of the mitochondrial route in Fas death is not clear, since evidence suggests that only a minority of cell lines require mitochondria to transmit the caspase-8 signal. If direct transmission of the signal from caspase-8 to the executioner caspase-3 occurs in most cell lines, what is the advantage of a mitochondrial intermediate? Usually, levels of complexity are added to allow additional regulation points, as clearly evidenced by the evolution of the vertebrate blood coagulation cascade. It is not immediately clear what advantage cells would achieve by adding a level of regulation to the Fas-triggered death signal, but future studies will doubtlessly focus on this issue. Regardless, it would appear that those cells in the body that are primed to undergo apoptosis during education of the immune system have evolved death receptors, caspase-8, and the caspase-8 activator complex to allow rapid direct transmission of the death signal, bypassing any mitochondrial requirement, and that pro-caspase-3 is a major physiologic substrate of caspase-8 (Fig. 7). Caspases are commonly divided into apical and executioner subsets (1Salvesen G.S. Dixit V.M. Cell. 1997; 91: 443-446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1932) Google Scholar, 33Chinnaiyan A.M. Dixit V.M. Curr. Biol. 1996; 6: 555-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). There exist two well characterized points at which apical caspases initiate apoptotic signals. One is at the cell surface where members of the TNFR-1 family of death receptors transmit a signal across the cell membrane following receptor clustering. The second point of initiation follows the release of mitochondrial factors (34Liu X. Kim C.N. Yang J. Jemmerson R. Wang X. Cell. 1996; 86: 147-157Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4433) Google Scholar,35Kroemer G. Zamzami N. Susin S.A. Immunol. Today. 1997; 18: 44-51Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1379) Google Scholar), and although this post-mitochondrial pathway is well documented it is unclear how the mitochondrion perceives the apoptotic signal. Nevertheless, anti-neoplastic drugs, genotoxic damage, and inhibition of cellular signal transduction pathways all seem to converge on the mitochondrial route (36Reed J.C. Cell. 1997; 91: 559-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (694) Google Scholar). At each point of initiation the first recognizable biochemical event is specific caspase activation, and each initiation point utilizes distinct caspases. In the death receptor pathway(s) the apical caspase-8 (and possibly 10) transmits a proteolytic signal following autoactivation at the cytosolic face of the receptor (4Muzio M. Chinnaiyan A.M. Kischkel F.C. O'Rourke K. Shevchenko A. Ni J. Scaffidi C. Bretz J.D. Zhang M. Gentz R. Mann M. Krammer P.H. Peter M.E. Dixit V.M. Cell. 1996; 85: 817-827Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2723) Google Scholar, 5Boldin M.P. Goncharov T.M. Goltsev Y.V. Wallach D. Cell. 1996; 85: 803-815Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2100) Google Scholar, 6Srinivasula S.M. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (480) Google Scholar, 37Fernandes-Alnemri T. Armstrong R. Krebs J. Srinivasula S.M. Wang L. Bullrich F. Fritz L. Trapani J.A. Croce C.M. Tomaselli K.J. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 7464-7469Crossref PubMed Scopus (692) Google Scholar, 38Vincenz C. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 6578-6583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (238) Google Scholar). The signal for activation appears to be local clustering of pro-caspase-8 that possesses enough activity in its zymogen to achieve autolytic proteolytic maturation (7Muzio M. Stockwell B.R. Stennicke H.R. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 2926-2930Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (882) Google Scholar, 8Yang X. Chang H.Y. Baltimore D. Mol Cell. 1998; 1: 319-325Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (368) Google Scholar, 39Martin D.A. Siegel R.M. Zheng L. Lenardo M.J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 4345-4349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (329) Google Scholar). In the mitochondrial route specific or nonspecific delivery of cytochromec (29Li P. Nijhawan D. Budihardjo I. Srinivasula S.M. Ahmad M. Alnemri E.S. Wang X. Cell. 1997; 91: 479-489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6183) Google Scholar, 40Zamzami N. Susin S.A. Marchetti P. Hirsch T. Gomez-Monterrey I.M.C. Kroemer G. J. Exp. Med. 1996; 183: 1533-1544Crossref PubMed Scopus (1262) Google Scholar, 41Kluck R.M. Bossy-Wetzel E. Green D.R. Newmeyer D.D. Science. 1997; 275: 1132-1136Crossref PubMed Scopus (4254) Google Scholar, 42Zou H. Henzel W.J. Liu X. Lutschg A. Wang X. Cell. 1997; 90: 405-413Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2727) Google Scholar) to the protein Apaf-1 results in recruitment and activation of caspase-9 (29Li P. Nijhawan D. Budihardjo I. Srinivasula S.M. Ahmad M. Alnemri E.S. Wang X. Cell. 1997; 91: 479-489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6183) Google Scholar). Both caspase-8 and caspase-9 have been demonstrated to act on in vitro translated pro-caspases-3 and -7, the executioner caspases whose activation correlates with apoptosis. Thus there are two potential routes to activate the executioner caspases, and in this context both caspases-8 and -9 can be thought of as initiators whose pathways converge at the execution phase of apoptosis. Although caspases-8 and -10 can activate pro-caspase-3 in vitro, it has proven difficult to determine whether the apical caspases perform this function directly or indirectly, because previous studies have relied on in vitro translated zymogens or cytosolic extracts (6Srinivasula S.M. Ahmad M. Fernandes-Alnemri T. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14486-14491Crossref PubMed Scopus (480) Google Scholar, 31Muzio M. Salvesen G.S. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 2952-2956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (312) Google Scholar, 37Fernandes-Alnemri T. Armstrong R. Krebs J. Srinivasula S.M. Wang L. Bullrich F. Fritz L. Trapani J.A. Croce C.M. Tomaselli K.J. Litwack G. Alnemri E.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 7464-7469Crossref PubMed Scopus (692) Google Scholar, 43Orth K. Chinnaiyan A.M. Garg M. Froelich C.J. Dixit V.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 16443-16446Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (374) Google Scholar). We here demonstrate that caspase-8 and -10 can rapidly activate caspase-3. More importantly, focusing on caspase-8 we observe that activation proceeds with the same rate in a 293 cytosolic extract, eliminating a requirement for an intermediary component. Additionally, depletion of pro-caspase-9 from the extract has no impact on caspase activation by caspase-8, and MCF-7 cells deficient in caspase-3 failed to support processing of pro-caspase-9. Therefore, processing of pro-caspase-9 in death receptor-mediated apoptosis requires the presence and activation of caspase-3 which makes it a downstream event unlikely to play a major role in caspase activation. It has been proposed that mitochondria are required to transmit the apoptotic signal generated by treatment of cells by agonistic Fas antibodies, but only in a small selection of cell lines (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar). This would imply that caspase-8, the apical caspase of the Fas pathway, initiates a mitochondrial signal. In support of this, the generation of caspase activity initiated by addition of human caspase-8 to cytosolic extracts of Xenopus eggs is accelerated in the presence of mitochondria (44Kuwana T. Smith J.J. Muzio M. Dixit V. Newmeyer D.D. Kornbluth S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16589-16594Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (335) Google Scholar). However, the relevance of this to homologous systems is unclear, since it is not known whether Xenopus has a caspase-8, and the kinetics of activation of a putativeXenopus caspase-3 ortholog, or whether the caspase activity in Xenopus extracts is due to such an ortholog, have not been determined. The data presented above, in contrast, do not suggest any requirement for an intermediary between caspase-8 and caspase-3. Therefore, the question is whether the mitochondrial acceleration occurs in vivo, and whether caspase-8 must transmit its signal via mitochondria to the executioners in vivo. Currently the most valuable evidence for a role of mitochondria in apoptosis triggered by death receptor ligation comes from several studies investigating expression of ectopic or transgenic Bcl-2, which is hypothesized to operate by blocking mitochondrial-dependent apoptosis (reviewed in Ref. 36Reed J.C. Cell. 1997; 91: 559-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (694) Google Scholar). Most investigators agree that Bcl-2 prevents apoptosis triggered by genotoxic damage, glucocorticoids, and chemotherapeutic drugs, but there are inconsistencies in the data describing the protective effect of Bcl-2 against apoptosis induced by death receptors (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar, 33Chinnaiyan A.M. Dixit V.M. Curr. Biol. 1996; 6: 555-562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 45Srinivasan A. Li F. Wong A. Kodandapani L. Smidt Jr., R. Krebs J.F. Fritz L.C. Wu J.C. Tomaselli K.J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 4523-4529Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (157) Google Scholar, 46Strasser A. Harris A.W. Huang D.C. Krammer P.H. Cory S. EMBO J. 1995; 14: 6136-6147Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). In a survey of several cell lines, Scaffidi et al. (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar) noted that most are not protected by Bcl-2 from apoptosis triggered by agonist Fas antibodies. However, the use of agonist antibodies and immortalized cell lines may not be the best way to determine a role for Bcl-2. More significantly, T-cell apoptosis in vivo, which is dependent on physiologic Fas ligation, is unaffected in Bcl-2 transgenic mice (46Strasser A. Harris A.W. Huang D.C. Krammer P.H. Cory S. EMBO J. 1995; 14: 6136-6147Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar). In contrast, death following injection of agonist Fas antibodies in whole mice was significantly retarded in Bcl-2 transgenic mice (47Lacronique V. Mignon A. Fabre M. Viollet B. Rouquet N. Molina T. Porteu A. Henrion A. Bouscary D. Varlet P. Joulin V. Kahn A. Nat. Med. 1996; 2: 80-86Crossref PubMed Scopus (348) Google Scholar). These somewhat contradictory studies can be reconciled if some cells support direct transmission of caspase-8 to caspase-3, while others require a mitochondrial accelerator (10Scaffidi C. Fulda S. Srinivasan A. Friesen C. Li F. Tomaselli K.J. Debatin K.M. Krammer P.H. Peter M.E. EMBO J. 1998; 17: 1675-1687Crossref PubMed Scopus (2617) Google Scholar). Since pro-caspase-9 is not processed by caspase-8, the mitochondrial accelerator must act upstream of the caspase-9 activator complex and, therefore, presumably upstream of the mitochondrion. Possibly the pro-apoptotic mitochondrial signal is activated by the action of caspase-8 on mitochondria, or a latent protein that activates mitochondria for apoptosis. The importance of the mitochondrial route in Fas death is not clear, since evidence suggests that only a minority of cell lines require mitochondria to transmit the caspase-8 signal. If direct transmission of the signal from caspase-8 to the executioner caspase-3 occurs in most cell lines, what is the advantage of a mitochondrial intermediate? Usually, levels of complexity are added to allow additional regulation points, as clearly evidenced by the evolution of the vertebrate blood coagulation cascade. It is not immediately clear what advantage cells would achieve by adding a level of regulation to the Fas-triggered death signal, but future studies will doubtlessly focus on this issue. Regardless, it would appear that those cells in the body that are primed to undergo apoptosis during education of the immune system have evolved death receptors, caspase-8, and the caspase-8 activator complex to allow rapid direct transmission of the death signal, bypassing any mitochondrial requirement, and that pro-caspase-3 is a major physiologic substrate of caspase-8 (Fig. 7). We thank Dr. Vishva Dixit for helpful discussion, and Scott Snipas and Annamarie Price for technical assistance.