Variants of the SPINK1 gene encoding pancreatic secretory trypsin inhibitor have been described in association with chronic pancreatitis (CP). These alterations are believed to cause a loss of function by either impairing the trypsin inhibitory activity or reducing expression. Here we report two novel SPINK1 variants in exon 1 that affect the secretory signal peptide. The disease-associated c.41T>G (p.L14R) alteration was found in two European families with autosomal dominant hereditary pancreatitis, whereas the c.36G>C (p.L12F) variant was identified as a frequent alteration in subjects of African descent. The functional effects of both alterations and the previously reported c.41T>C (p.L14P) variant were characterized by activity assays and Western blots of wild-type and mutant SPINK1 expressed in human embryonic kidney 293T and Chinese hamster ovary cells. Alterations p.L14R and p.L14P destined the inhibitor for rapid intracellular degradation and thereby abolished SPINK1 secretion, whereas the p.L12F variant showed no detrimental effect. The results provide the first clear experimental demonstration that alterations that markedly reduce SPINK1 expression are associated with classic hereditary pancreatitis. Therefore, these variants should be classified as severe and regarded as disease-causing rather than disease-modifiers. Hum Mutat 28(5), 469–476, 2007. Published 2007 Wiley-Liss, Inc.

Variations in the SPINK1 gene (encoding pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI)) are associated with chronic pancreatitis. We have recently determined the functional consequences of three missense mutations that occurred within the signal peptide sequence of PSTI by Western blotting analysis of wild-type and mutant PSTI expressed in Chinese hamster ovary cells. Here, this approach was extended to analyze seven missense mutations (p.N34S, p.G48E, p.D50E, p.Y54H, p.P55S, p.R65Q and p.R67C) occurring within the mature peptide of PSTI. This analysis enabled us to classify these missense mutations into three categories. The first category comprises the p.N34S and p.P55S polymorphisms, both of which occur in evolutionarily non-conserved residues, involve amino-acid substitutions with similar physicochemical properties, and do not cause any significant reduction in terms of PSTI mature peptide expression. The second category contains only the p.R65Q missense mutation, which occurs in a well-conserved residue, involves the substitution of a positively charged amino acid by a non-charged one, and causes a ∼60% reduction of protein expression. The third category comprises p.G48E, p.D50E, p.Y54H, and p.R67C, all of which occur in strictly conserved residues, involve charged amino acids, and cause complete or nearly complete loss of PSTI expression. Having excluded the possibility that the reduced protein expression may have resulted from reduced transcription or unstable mRNA, we surmise that these missense mutations probably cause intracellular retention of their respective mutant proteins. This is suggestive of a potential unifying pathological mechanism underlying both the signal peptide and mature peptide mutations.

A hybrid allele between the carboxyl ester lipase gene (CEL) and its pseudogene, CELP (called CEL-HYB), generated by nonallelic homologous recombination between CEL intron 10 and CELP intron 10', was found to increase susceptibility to chronic pancreatitis in a case-control study of patients of European ancestry. We attempted to replicate this finding in 3 independent cohorts from China, Japan, and India, but failed to detect the CEL-HYB allele in any of these populations. The CEL-HYB allele might therefore be an ethnic-specific risk factor for chronic pancreatitis. An alternative hybrid allele (CEL-HYB2) was identified in all 3 Asian populations (1.7% combined carrier frequency), but was not associated with chronic pancreatitis.

Recently, we reported the identification of a functional PRSS1 promoter variant in perfect linkage disequilibrium (LD) with the chronic pancreatitis (CP)-‘protective’ rs10273639.1 This, together with several other recent papers published in Gut ,2–4 underscored the importance of functional analysis for improving our understanding of the underlying pathophysiological mechanisms and also more fundamentally for establishing the clinical relevance or otherwise of CP-associated variants from the outset. In many diseases, in vitro functional analysis often represents the only practical means to determine the pathogenicity of patient-derived sequence variants, particularly when they are rare. Herein, we present a new and successful example in the context of CP. SPINK1 is one of the most extensively studied CP genes, with >100 variants being reported to date.5 Of 19 known intronic variants, the four in LD with the p.Asn34Ser variant have been functionally analysed in the context of both minigene6 and full-length genomic sequence7; none had any detectable effect on pre-mRNA splicing. In addition, the functional consequences of the c.194+2T>C splice donor site variant …

We read with interest the paper by Derikx et al 1 replicating the association of the minor T allele of single nucleotide polymorphism rs10273639C/T, which is located 408 bp upstream of the translation initiation codon of the cationic trypsinogen ( PRSS1 ) gene, with a protective effect against chronic pancreatitis.2 However, whether rs10273639 is the causal variant or not remains unknown. Resolving this issue is of intrinsic biological interest, and it may also have diagnostic and therapeutic value. During resequencing of the promoter region of PRSS1 in 287 French Caucasian individuals (see online supplementary material), we found that rs4726576C/A, which is located 204 bp upstream of the translation initiation codon of PRSS1 (figure 1A), is in perfect linkage disequilibrium (LD) with rs10273639C/T (figure 2A). To identify which polymorphism is of potential biological relevance, we performed a two-step luciferase promoter reporter assay (see online supplementary material). First, we sought to establish whether the proximal promoter of PRSS1 is sufficient to drive specific gene expression. We thus constructed two luciferase reporter plasmids in the context of the two major alleles, one encompassing the two polymorphic sites …

It has long been known that canonical 5′ splice site (5′SS) GT>GC variants may be compatible with normal splicing. However, to date, the actual scale of canonical 5′SSs capable of generating wild-type transcripts in the case of GT>GC substitutions remains unknown. Herein, combining data derived from a meta-analysis of 45 human disease-causing 5′SS GT>GC variants and a cell culture-based full-length gene splicing assay of 103 5′SS GT>GC substitutions, we estimate that ~15–18% of canonical GT 5′SSs retain their capacity to generate between 1% and 84% normal transcripts when GT is substituted by GC. We further demonstrate that the canonical 5′SSs in which substitution of GT by GC-generated normal transcripts exhibit stronger complementarity to the 5′ end of U1 snRNA than those sites whose substitutions of GT by GC did not lead to the generation of normal transcripts. We also observed a correlation between the generation of wild-type transcripts and a milder than expected clinical phenotype but found that none of the available splicing prediction tools were capable of reliably distinguishing 5′SS GT>GC variants that generated wild-type transcripts from those that did not. Our findings imply that 5′SS GT>GC variants in human disease genes may not invariably be pathogenic.

The SPINK1 gene, encoding the human pancreatic secretory trypsin inhibitor, is one of the major genes involved in predisposition to chronic pancreatitis (CP). In this study we have assessed the potential functional impact of 11 SPINK1 promoter variants by means of both luciferase reporter gene assay and electrophoretic mobility shift assay (EMSA), using human pancreatic COLO-357 cells as an expression system. The 11 promoter variants were found to be separable into three distinct categories on the basis of the reporter gene assay results viz loss-of-function, gain-of-function and functionally neutral. These findings, which were validated by EMSA, concurred with data from previous deletion studies and DNase I footprinting assays. Further, binding sites for two transcription factors, HNF1 and PTF1, were newly identified within the SPINK1 promoter by virtue of their being affected by specific variants. Combining the functional data with epidemiological data (derived by resequencing the SPINK1 promoter region in French, German and Indian CP patients and controls), then allowed us to make meaningful inferences as to each variant's likely contribution to CP. We conclude that only the three promoter variants associated with a loss-of-function (ie, −53C>T, −142T>C and −147A>G) are likely to be disease-predisposing alterations.

The haplotype harboring the SPINK1 c.101A>G (p.Asn34Ser) variant (also known as rs17107315:T>C) represents the most important heritable risk factor for idiopathic chronic pancreatitis identified to date. The causal variant contained within this risk haplotype has however remained stubbornly elusive. Herein, we set out to resolve this enigma by employing a hypothesis-driven approach. First, we searched for variants in strong linkage disequilibrium (LD) with rs17107315:T>C using HaploReg v4.1. Second, we identified two candidate SNPs by visual inspection of sequences spanning all 25 SNPs found to be in LD with rs17107315:T>C, guided by prior knowledge of pancreas-specific transcription factors and their cognate binding sites. Third, employing a novel cis-regulatory module (CRM)-guided approach to further filter the two candidate SNPs yielded a solitary candidate causal variant. Finally, combining data from phylogenetic conservation and chromatin accessibility, cotransfection transactivation experiments, and population genetic studies, we suggest that rs142703147:C>A, which disrupts a PTF1L-binding site within an evolutionarily conserved HNF1A−PTF1L CRM located ∼4 kb upstream of the SPINK1 promoter, contributes to the aforementioned chronic pancreatitis risk haplotype. Further studies are required not only to improve the characterization of this functional SNP but also to identify other functional components that might contribute to this high-risk haplotype.

Boulling, Arnaud PhD; Keiles, Steven MS, CGC; Masson, Emmanuelle PhD; Chen, Jian-Min MD, PhD; Férec, Claude MD, PhD Author Information

We read with interest the recent publication of Beer and Sahin-Toth1 reporting that exonic variants affecting pre-mRNA splicing contribute to the genetic burden in chronic pancreatitis. One particular variant, affecting the last nucleotide of exon 3 of the SPINK1 gene, c.194G>A, was found to cause an ∼80% reduction in SPINK1 mRNA expression as compared with the wild type in a minigene assay performed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells. The SPINK1 sequence inserted into the minigene expression vector however comprised only exon 1, exon 2, exon 3, intron 3 and exon 4 of the four-exon gene.1 It should be noted that the potential effect of c.194G>A as a missense mutation (p.Arg65Gln) on protein function has previously been analysed; engineered expression of the full-length mutant coding sequence in Chinese hamster ovary cells and HEK293T cells showed a consistent 50%–60% reduction in protein secretion as compared with the wild type.2 ,3 We recently analysed the functional consequences of 24 SPINK1 intronic variants in relation to their associated mRNA splicing phenotypes4 ,5 by means of a full-gene splicing assay in which the full-length 7 kb SPINK1 genomic sequence (including all four exons plus all three introns of the gene) was cloned into the pcDNA3.1/V5-His-TOPO vector.6 This full-length gene expression system has already proved itself in practice by accurately representing the in vivo situation in the context …