In contrast to animals, little is known about pattern formation in plants. Physiological and genetic data suggest the involvement of the phytohormone auxin in this process. Here, we characterize a novel member of the PIN family of putative auxin efflux carriers, Arabidopsis PIN4, that is localized in developing and mature root meristems. Atpin4 mutants are defective in establishment and maintenance of endogenous auxin gradients, fail to canalize externally applied auxin, and display various patterning defects in both embryonic and seedling roots. We propose a role for AtPIN4 in generating a sink for auxin below the quiescent center of the root meristem that is essential for auxin distribution and patterning.

Developmental responses to the plant hormone auxin are thought to be mediated by interacting pairs from two protein families: short-lived inhibitory IAA proteins and ARF transcription factors binding to auxin-response elements. monopteros mutants lacking activating ARF5 and the auxin-insensitive mutant bodenlos fail to initiate the root meristem during early embryogenesis. Here we show that the bodenlos phenotype results from an amino-acid exchange in the conserved degradation domain of IAA12. BODENLOS and MONOPTEROS interact in the yeast two-hybrid assay and the two genes are coexpressed in early embryogenesis, suggesting that BODENLOS inhibits MONOPTEROS action in root meristem initiation.

Abstract The plant cell wall is a dynamic and complex structure whose functional integrity is constantly being monitored and maintained during development and interactions with the environment. In response to cell wall damage (CWD), putatively compensatory responses, such as lignin production, are initiated. In this context, lignin deposition could reinforce the cell wall to maintain functional integrity. Lignin is important for the plant’s response to environmental stress, for reinforcement during secondary cell wall formation, and for long-distance water transport. Here, we identify two stages and several components of a genetic network that regulate CWD-induced lignin production in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). During the early stage, calcium and diphenyleneiodonium-sensitive reactive oxygen species (ROS) production are required to induce a secondary ROS burst and jasmonic acid (JA) accumulation. During the second stage, ROS derived from the NADPH oxidase RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG D and JA-isoleucine generated by JASMONIC ACID RESISTANT1, form a negative feedback loop that can repress each other’s production. This feedback loop in turn seems to influence lignin accumulation. Our results characterize a genetic network enabling plants to regulate lignin biosynthesis in response to CWD through dynamic interactions between JA and ROS.

Article5 May 2005free access Developmental specificity of auxin response by pairs of ARF and Aux/IAA transcriptional regulators Dolf Weijers Dolf Weijers ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Eva Benkova Eva Benkova ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Katja E Jäger Katja E Jäger ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, GermanyPresent address: Department of Cell and Developmental Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, UK Search for more papers by this author Alexandra Schlereth Alexandra Schlereth ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Thorsten Hamann Thorsten Hamann ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, GermanyPresent address: Department of Plant Biology, Carnegie Institution of Washington, Stanford, CA 94305, USA Search for more papers by this author Marika Kientz Marika Kientz ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Jill C Wilmoth Jill C Wilmoth Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA Search for more papers by this author Jason W Reed Jason W Reed Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA Search for more papers by this author Gerd Jürgens Corresponding Author Gerd Jürgens ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Dolf Weijers Dolf Weijers ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Eva Benkova Eva Benkova ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Katja E Jäger Katja E Jäger ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, GermanyPresent address: Department of Cell and Developmental Biology, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, UK Search for more papers by this author Alexandra Schlereth Alexandra Schlereth ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Thorsten Hamann Thorsten Hamann ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, GermanyPresent address: Department of Plant Biology, Carnegie Institution of Washington, Stanford, CA 94305, USA Search for more papers by this author Marika Kientz Marika Kientz ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Jill C Wilmoth Jill C Wilmoth Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA Search for more papers by this author Jason W Reed Jason W Reed Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA Search for more papers by this author Gerd Jürgens Corresponding Author Gerd Jürgens ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany Search for more papers by this author Author Information Dolf Weijers1,‡, Eva Benkova1,‡, Katja E Jäger1, Alexandra Schlereth1, Thorsten Hamann1, Marika Kientz1, Jill C Wilmoth2, Jason W Reed2 and Gerd Jürgens 1 1ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Tübingen, Germany 2Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. ZMBP Entwicklungsgenetik, Universität Tübingen, Auf der Morgenstelle 3, 72076 Tübingen, Germany. Tel.: +49 7071 297 8887; Fax: +49 7071 297 5797; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2005)24:1874-1885https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600659 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The plant hormone auxin elicits many specific context-dependent developmental responses. Auxin promotes degradation of Aux/IAA proteins that prevent transcription factors of the auxin response factor (ARF) family from regulating auxin-responsive target genes. Aux/IAAs and ARFs are represented by large gene families in Arabidopsis. Here we show that stabilization of BDL/IAA12 or its sister protein IAA13 prevents MP/ARF5-dependent embryonic root formation whereas stabilized SHY2/IAA3 interferes with seedling growth. Although both bdl and shy2-2 proteins inhibited MP/ARF5-dependent reporter gene activation, shy2-2 was much less efficient than bdl to interfere with embryonic root initiation when expressed from the BDL promoter. Similarly, MP was much more efficient than ARF16 in this process. When expressed from the SHY2 promoter, both shy2-2 and bdl inhibited cell elongation and auxin-induced gene expression in the seedling hypocotyl. By contrast, gravitropism and auxin-induced gene expression in the root, which were promoted by functionally redundant NPH4/ARF7 and ARF19 proteins, were inhibited by shy2-2, but not by bdl protein. Our results suggest that auxin signals are converted into specific responses by matching pairs of coexpressed ARF and Aux/IAA proteins. Introduction The small signaling molecule auxin elicits a multitude of developmental and physiological responses, such as patterning in embryogenesis, apical dominance, cell elongation and gravitropism (Berleth and Sachs, 2001). The cellular response to auxin involves changes in gene regulation. Genes upregulated by auxin contain in their promoters auxin-response elements (AuxRE), which bind transcription factors of the auxin response factor (ARF) family (Ulmasov et al, 1997a, 1999). At low auxin concentrations, ARFs are thought to be inhibited by interacting proteins of the Aux/IAA family via domains III and IV that are conserved between the two protein families (Ulmasov et al, 1997b). Aux/IAA genes were originally identified as genes that are rapidly upregulated in response to auxin (Abel et al, 1994). High auxin concentrations promote degradation of Aux/IAA proteins, which would release interacting ARFs from inhibition (Tiwari et al, 2001, 2003). Degradation of Aux/IAA proteins involves their conserved domain II, which mediates interaction with the SCFTIR1 ubiquitin-ligase complex for targeting of Aux/IAAs to the proteasome (Gray et al, 2001). Amino-acid exchanges in conserved residues of domain II affect the interaction with the SCFTIR1 ubiquitin-ligase complex, stabilizing mutant Aux/IAA proteins (Ramos et al, 2001). Such stabilizing mutations have been reported for 10 Aux/IAA genes (Reed, 2001; Hellmann and Estelle, 2002; Tatematsu et al, 2004; Yang et al, 2004). How is a generic signal such as auxin converted into specific context-dependent developmental responses? Auxin can increase the affinity between the SCFTIR1 ubiquitin-ligase complex and Aux/IAA proteins in a cell-free system without modifying the latter (Dharmasiri et al, 2003; Tian et al, 2003; Kepinski and Leyser, 2004). This observation suggests that the specificity of response to auxin is generated by interacting Aux/IAA and ARF proteins present in the auxin-responsive cell. The Arabidopsis genome encodes 22 ARF and 29 Aux/IAA proteins (Remington et al, 2004). Several ARFs have been assigned roles in specific developmental processes on the basis of their loss-of-function mutant phenotypes (Berleth and Jürgens, 1993; Przemeck et al, 1996; Sessions et al, 1997; Hardtke and Berleth, 1998; Harper et al, 2000; Nemhauser et al, 2000; Li et al, 2004; Tian et al, 2004). Although ARFs appear to have unique functions in some contexts, they display overlapping functions in others (Hardtke et al, 2004; Li et al, 2004). For example, MP/ARF5 is required for embryonic root initiation whereas both MP and NPH4/ARF7 contribute to cotyledon development (Hardtke et al, 2004). A larger number of Aux/IAA proteins have been implicated in diverse processes on the basis of their gain-of-function mutant phenotypes (Reed, 2001; Tatematsu et al, 2004; Yang et al, 2004). The mutant phenotypes are distinct for some Aux/IAA proteins but related for others, suggesting both distinct and overlapping roles in development. For example, stabilized BDL/IAA12 protein interferes with embryonic root initiation as does the loss of MP/ARF5 protein, suggesting that these two proteins generate a specific developmental response (Hamann et al, 2002). In contrast to ARF genes, no loss-of-function phenotypes have been reported for Aux/IAA genes except SHY2/IAA3, which is involved in seedling development (Tian and Reed, 1999). Most of the Aux/IAA genes exist as sister genes that appear to have originated by segmental duplications of the genome whereas ARF genes are not located in duplicated segments (Remington et al, 2004). For example, one pair of sister genes consists of BDL/IAA12, which is involved in embryonic root initiation, and IAA13 (Hamann et al, 1999, 2002). It is not known whether IAA13 performs a comparable role to BDL or rather acts in a different process. Furthermore, although mutations in different ARF and Aux/IAA genes cause distinct phenotypes, it is unclear how these proteins contribute to specificity of action. Here we address how Aux/IAA and ARF proteins generate specific responses to auxin. The effects of stabilized BDL and SHY2 proteins on embryonic root formation and seedling development were analyzed by swapping their gene promoters. These proteins were also assayed for their ability to inhibit MP-dependent gene activation in the absence of plant-specific accessory factors. Finally, candidate ARF proteins for interaction with BDL or SHY2 were examined for roles in BDL- and SHY2-dependent processes. Our results suggest that transcriptionally regulated optimized pairs of interacting Aux/IAA–ARF proteins generate developmental specificity of auxin response. Results IAA13 is a functional paralog of BDL/IAA12 Many Aux/IAA genes, including BDL/IAA12 and its closest homolog IAA13 (At2g33310), appear in regions of segmental genome duplications (Remington et al, 2004). To examine whether IAA13 is functionally related to BDL/IAA12, we first introduced a proline to serine mutation (iaa13P80S; Figure 1A) in the conserved domain II of a Myc-epitope-tagged transgenic copy of the IAA13 gene. The homologous mutation in the BDL gene causes semidominant gain-of-function phenotypes, both in the bdl mutant and when provided as a transgene (Hamann et al, 2002). Plants carrying the iaa13P80S transgene resembled bdl mutants in all respects. A single transgene copy caused stunted growth (not shown), whereas two copies caused embryonic phenotypes (Figure 1B). Homozygous iaa13P80S seedlings had no root, and the origin of this defect could be traced to a failure in the specification of the hypophysis-, the embryonic root meristem precursor- and subsequent abnormal cell division patterns (Figure 1B). Western blot analysis showed that the engineered iaa13P80S mutation led to the stabilization of the IAA13 protein (Figure 1C). This effect was quantitatively similar to the stabilization of the BDL protein in bdl mutants (Figure 1C), and caused comparable frequencies of embryo phenotypes (Table I). Figure 1.Expression of IAA13, and analysis of an iaa13 stabilizing mutation. (A) Domain structure of Aux/IAA proteins. The four conserved domains are depicted. Below is the consensus amino-acid sequence in conserved domain II of the engineered iaa13P80S mutation, of bdl and of shy2-2. (B) Rootless seedling homozygous for the iaa13P80S mutation (left); inset: bdl seedling. Comparison of a wild-type (middle) and homozygous iaa13P80S (right) globular stage embryo shows defects in hypophysis (hyp) specification; inset: abnormal division of hypophysis in bdl embryo. (C) Western blots (Myc antibody) of protein extracts from pBDL∷BDL, pBDL∷bdl, pIAA13∷IAA13 and pIAA13∷iaa13P80S seedlings. Individual lanes represent independent transgenics. Asterisk: unspecific crossreacting band demonstrating equal loading. (D) mRNA in situ hybridization with an IAA13 antisense probe in wild-type and bdl (right) embryos. RNA signals are in red-brown. (E) GUS activity in pIAA13∷GUS embryos and seedling root tip (right). Download figure Download PowerPoint Table 1. Frequencies of rootless phenotypes in genotypes used in this study Genotype Line # Rootless seedlings (% (N)) Defective embryos (% (N)) Columbia WT 1.4 (141) pBDL∷SHY2 2 1.1 (72) 6 0.7 (124) 0.5 (187) pBDL∷shy2-2 5 0 (430) 19 4.4 (280) 20 9.8 (283) 7.1 (70) 22 8.0 (63) 9.7 (124) 24 9.1 (212) 29 27.6 (134) 38 9.4 (112) pBDL∷BDL 38 0 (148) 0 (81) pBDL∷bdl 27 19.4 (66) 21.1 (19) 41 24.6 (61) 32.2 (59) 73 60.8 (51) pBDL∷IAA13 11 2.5 (115) 2.2 (138) pBDL∷iaa13P80S 5 25.2 (283) 25.5 (108) 28 29.6 (68) 38 12.2 (317) 28.3 (53) pIAA13∷IAA13 12 0.9 (94) 17 0.8 (129) pIAA13∷iaa13P80S 4 32.6 (177) 11 23.9 (102) 23 29.0 (62) pIAA13∷BDL 5 0 (131) 8 1.3 (130) pIAA13∷bdl 1 26.2 (166) 7 28.5 (35) 29.4 (68) 30 23.1 (337) 22.8 (206) pSHY2∷shy2-2 11 0 (55) pSHY2∷bdl 4 0 (48) 0.7 (150) 12 0 (30) pSHY2∷iaa13P80S 7 2.5 (38) 1.9 (161) 11 5.0 (20) bdl 22.3 (264) The phenotypic equivalence of bdl and iaa13P80S gain-of-function mutations suggests that the two genes are expressed in a similar way. mRNA in situ hybridization revealed that the IAA13 gene is first transcribed specifically in the globular proembryo, but not the hypophysis (Figure 1D). Later, expression extends basally to the lens-shaped apical daughter cell of the hypophysis (Figure 1D). Finally, IAA13 mRNA accumulation is restricted to the future vascular tissue (Figure 1D). The identical expression pattern was previously detected for BDL (Hamann et al, 2002). IAA13 mRNA expression was unchanged in bdl mutants (Figure 1D), excluding the possibility that IAA13 acts downstream of BDL. Furthermore, IAA13 promoter-GUS fusions revealed that the IAA13 expression pattern is regulated at the level of gene transcription (Figure 1E). In conclusion, the IAA13 gene is a functional paralog of BDL. Aux/IAA specificity in embryogenesis is transcriptionally regulated To assess the relative contributions of transcriptional regulation of Aux/IAA genes and Aux/IAA protein determinants in specificity of action in the embryo, a promoter-swap strategy was adopted. The promoters of BDL or IAA13 were fused to Myc-epitope-tagged genomic coding regions of the SHY2/IAA3, BDL or IAA13 genes. Homologous stabilizing proline to serine domain II mutations (SHY2P69S—shy2-2 (Tian and Reed, 1999); BDLP72S—bdl (Hamann et al, 2002); IAA13P80S) were introduced into each construct, and wild-type versions of the transgenes were analyzed as controls. In accordance with the similar BDL and IAA13 gene activities, pBDL∷iaa13P80S and pIAA13∷bdl plants showed embryonic and postembryonic phenotypes comparable to the bdl and iaa13P80S mutants (Figure 2A; Table I; not shown). Notably, however, whereas shy2-2 mutants have no embryonic phenotypes (Tian and Reed, 1999; Table I), pBDL∷shy2-2 plants showed a rootless phenotype similar to that of bdl (Figure 2A). In addition, pBDL∷shy2-2 plants showed bdl-like postembryonic growth abnormalities (Figure 2B). Although phenotypes were qualitatively similar in all genotypes, the frequency of embryonic phenotypes was significantly lower in pBDL∷shy2-2 plants (Table I). However, Western blot analysis showed that shy2-2, bdl and iaa13P80S proteins accumulated to comparable levels (Figure 2C). These results suggest that the specificity of BDL and IAA13 action in embryogenesis is mainly regulated at the level of gene transcription, but other Aux/IAA proteins may also affect root formation when expressed in the embryo. Figure 2.BDL promoter-swap experiments. (A) Rootless pBDL∷shy2-2 and pBDL∷iaa13P80S homozygous seedlings; inset: pBDL∷bdl seedling. (B) Flowering plants (4 weeks old) are bushy and short; inset: heterozygous bdl plant. (C) Western blots of protein extracts from pBDL∷SHY2, pBDL∷shy2-2, pBDL∷IAA13 and pBDL∷iaa13P80S seedlings. Asterisk: unspecific crossreacting band demonstrating approximately equal loading. Percentage of rootless seedlings (%RL) is indicated for each line. Download figure Download PowerPoint The ARF transcription factor that likely acts in concert with BDL and IAA13 in the embryo is MONOPTEROS (MP)/ARF5 (Hardtke and Berleth, 1998; Hamann et al, 2002). To examine whether the ability to inhibit MP activity reflects the activity of bdl and shy2-2 in the embryo, we developed a heterologous assay for ARF and Aux/IAA activity. A direct repeat of eight ARF-binding DR5(rev) repeat sequences (Ulmasov et al, 1997b) was placed upstream of a minimal promoter for expression in yeast, and this yDR5 (yeast-DR5) promoter was fused to the lacZ gene for β-galactosidase. When HA-epitope-tagged MP cDNA was expressed in yDR5∷lacZ yeast cells, the activity of the reporter was induced several-fold (Figure 3A). Next, HA-epitope-tagged cDNAs of SHY2 or BDL were introduced on the same plasmid as MP:HA. Coexpression of SHY2:HA or BDL:HA with MP:HA nearly completely repressed MP:HA activity (Figure 3A), showing that both proteins can inhibit MP activity. Western blot analysis consistently showed that MP:HA, SHY2:HA and BDL:HA were expressed in yeast, indicating that SHY2 and BDL did not interfere with MP expression. However, SHY2:HA consistently accumulated to higher levels than BDL:HA (Figure 3B), presumably because of cleavage of the BDL:HA protein (not shown). This assay shows that both SHY2 and BDL can directly inhibit MP transcription factor activity in the absence of plant-specific accessory factors, and BDL may be more potent than SHY2. Figure 3.Repression of MP activity by SHY2 and BDL in yeast. (A) Galactosidase activity in yDR5 yeast cells expressing the empty vector (−), MP:HA (MP), MP:HA and SHY2:HA (MP+SHY2) or MP:HA and BDL:HA (MP+BDL). Values (±s.d.) are the average of 12 independent transformants. Asterisks represent statistically significant difference between MP and – (*P<0.001, two-tailed Student's t-test), MP+SHY2 and MP (**P<0.001, two-tailed Student's t-test), and MP+BDL and MP (**P<0.001, two-tailed Student's t-test). (B) Western blot (HA antibody) with equal amounts of protein extracts from three independent yeast transformants for each plasmid. The regions from the same blot that represent MP:HA (105 kDa), SHY2:HA (25 kDa) and BDL:HA (29 kDa) are depicted. Note that expression levels of MP:HA protein vary between different colonies of the same genotype. Download figure Download PowerPoint Aux/IAA specificity in hypocotyl and shoot is transcriptionally regulated Elongation of the seedling hypocotyl involves SHY2-dependent auxin responses (Tian and Reed, 1999; Tian et al, 2002). In contrast, bdl mutants show normal hypocotyl elongation (Hamann et al, 1999). SHY2 is predominantly expressed in cotyledons and hypocotyl including peripheral cell layers whereas BDL expression is largely confined to the central vascular strands (Hamann et al, 2002; Tian et al, 2002). To assess if the specificity of SHY2 action in the hypocotyl is also subject to transcriptional regulation, we expressed Myc-epitope-tagged bdl or iaa13P80S proteins from the SHY2 promoter, and compared their phenotypes with pSHY2∷shy2-2 seedlings. The pSHY2∷shy2-2 construct induced hypocotyl elongation defects in both light- and dark-grown seedlings (Figure 4A), and the severity of defects correlated well with the level of mutant protein accumulation (Figure 4B). By comparison, pSHY2∷bdl and pSHY2∷iaa13P80S seedlings showed a slightly stronger inhibition of hypocotyl elongation (Figure 4A) although mutant proteins accumulated to lower levels than in pSHY2∷shy2-2 seedlings (Figure 4B). These results suggest that, as in embryonic root formation, bdl and iaa13 mutant proteins are more effective than the shy2-2 protein in inhibiting auxin responses. Subsequent shoot development in pSHY2∷shy2-2, pSHY2∷bdl and pSHY2∷ iaa13P80S plants resembled that of shy2-2 mutants (Figure 4C; Tian and Reed, 1999). However, the phenotypes were again quantitatively different between the genotypes. Plants from different pSHY2∷shy2-2 lines showed different phenotypic strengths, ranging from those seen in shy2-2 heterozygotes to those of shy2-2 homozygotes, whereas the phenotypes of the other two transgenic genotypes strongly resembled shy2-2 homozygotes (Figure 4C). Figure 4.Inhibition of auxin responses in the shoot by stabilized Aux/IAA proteins. (A) Hypocotyl length in light-grown (white bars) or dark-grown (black bars) seedlings of wild type (COL), pSHY2∷SHY2, pSHY2∷shy2-2 (lines #27, #6 and #13), pSHY2∷BDL, pSHY2∷bdl (lines #4 and #12), pSHY2∷IAA13, pSHY2∷iaa13P80S (lines #7 and #11) and shy2-2. Hypocotyl length (±s.d.) is represented as percentage of COL. (B) Western blot of protein extracts from light-grown seedlings in (A). Blot was probed with anti-Myc antibodies; asterisk: unspecific crossreacting band demonstrating equal loading. (C) Phenotypes of flowering plants. (D) GUS activity in hypocotyl of seedlings hemizygous for pSHY2∷GUS and pSHY2∷shy2-2, pSHY2∷bdl or wild-type controls from same cross. Seedlings were treated with IAA for 5 h and stained for GUS activity. Download figure Download PowerPoint Aux/IAA proteins act primarily at the level of auxin-dependent gene expression (Tiwari et al, 2001). To test whether this process is similarly affected in pSHY2∷shy2-2 and pSHY2∷bdl seedlings, we analyzed auxin-dependent pSHY2∷GUS activity. In wild-type hypocotyls, pSHY2∷GUS was induced by auxin in the outer cell layers (Figure 4D). This auxin-induced expression was almost completely lost in the hypocotyl of both pSHY2∷shy2-2 and pSHY2∷bdl seedlings (Figure 4D). Thus, SHY2 activity feeds back on SHY2 gene expression, and this function can be taken over by BDL protein, indicating functional equivalence of the two Aux/IAA proteins in this specific auxin response. At similar protein concentrations, bdl appeared to have a stronger effect than did shy2 on the hypocotyl and shoot phenotypes, just as it did for embryo phenotypes. Taken together, these results suggest that specificity of SHY2 action in hypocotyl and shoot is determined by the activity of its promoter, with protein determinants affecting only the extent to which auxin responses are inhibited. Aux/IAA protein specificity in auxin-mediated root development The shy2-2 mutation not only affects auxin responses in hypocotyl and shoot, but also in the root (Tian and Reed, 1999). To examine whether the specificity of SHY2 action in the root is also transcriptionally regulated, we studied root-specific auxin responses in pSHY2∷shy2-2 and pSHY2∷bdl seedlings. Alignment of the root tip with a changing gravity vector requires auxin response, and this response is strongly diminished in shy2-2 as well as in pSHY2∷shy2-2 roots (Tian and Reed, 1999; Figure 5A). Surprisingly, roots of pSHY2∷bdl seedlings responded almost normally to gravity although their hypocotyls displayed strong inhibition of elongation (Figure 5A, compare with Figure 4A). Similarly, although root growth was comparably reduced in both pSHY2∷shy2-2 and pSHY2∷bdl seedlings under normal conditions, the two genotypes differed in their response to the growth-inhibiting effects of auxin (Figure 5B). Whereas pSHY2∷bdl root growth was sensitive, shy2-2 and pSHY2∷shy2-2 root growth was partially resistant (Figure 5B). This difference in auxin response between pSHY2∷shy2-2 and pSHY2∷bdl roots must lie in the shy2-2 and bdl proteins themselves because both are expressed in the root (Figure 5C). Figure 5.Inhibition of auxin responses in the root by shy2-2, but not by bdl. (A) Gravitropic response of pSHY2∷SHY2, pSHY2∷shy2-2, pSHY2∷BDL and pSHY2∷bdl seedlings after reorientation by 90° (data from two to five independent transgenic lines for each genotype). The percentages represent the fraction of seedlings (numbers analyzed in parentheses) with normal gravitropic response. (B) Inhibition of root growth by 2,4-D. Root length (±s.d.) was measured after 3 days of vertical growth on medium with (black bars) or without (white bars) 0.1 μM 2,4-D. Growth is represented as percentage of root length in wild type (COL) on control media. (C) Western blots of protein extracts from IAA-treated (10 μM for 5 h) or untreated roots of pSHY2∷SHY2, pSHY2∷shy2-2, pSHY2∷BDL and pSHY2∷bdl seedlings. Asterisks: unspecific crossreaction as loading control. Note that SHY2 or BDL accumulation is induced by auxin in pSHY2∷SHY2, pSHY2∷BDL and pSHY2∷bdl, but not in pSHY2∷shy2-2. (D) GUS activity in root tips of F1 seedlings from crosses between hemizygous pSHY2∷shy2-2 or pSHY2∷bdl lines and homozygous pSHY2∷GUS or pDR5(7x)∷GUS lines. Controls (WT) are wild-type segregants from the same cross. −IAA, untreated; +IAA, 10 μM IAA for 5 h. GUS staining time was 3 h for untreated and 1.5 h for IAA-treated roots. Download figure Download PowerPoint As in the hypocotyl, auxin responses in the root involve changes in gene expression. The shy2-2 mutation and pSHY2∷shy2-2 prevented the auxin-induced expression of pSHY2∷GUS and pDR5(7x)∷GUS (Figure 5D; Tian et al, 2002). In contrast, pSHY2∷bdl roots showed normal auxin-induced expression of both reporters (Figure 5D). The noninduced expression in the root vascular tissues and the distal tip was similarly affected in both pSHY2∷shy2-2 and pSHY2∷bdl (Figure 5D). In summary, bdl did not regulate auxin-induced gene expression or gravitropism in roots, even when present at similar protein levels to levels of shy2-2 that have a strong effect on these phenotypes. These results indicate that shy2-2 is effective in inhibiting auxin-mediated root development whereas bdl is not, which is in contrast to the stronger activity of bdl in embryo development, auxin response in the hypocotyl, and shoot and root growth. ARF7 and ARF19 as targets of Aux/IAA inhibition in auxin-mediated root development Aux/IAA proteins inhibit auxin responses through interactions with ARF transcription factors (Tiwari et al, 2003). Hence, a plausible explanation for the differential effects of pSHY2∷shy2-2 and pSHY2∷bdl on auxin-dependent root development would be that shy2-2, but not bdl, interacts with a yet unidentified ARF that regulates these auxin responses. To date, no arf mutant has been reported to have root phenotypes that resemble shy2-2. We took a candidate approach to identify ARF protein(s) involved in auxin-dependent root development. Initially, we analyzed double mutants for ARF10 and ARF16, two closely related genes (Remington et al, 2004) that are highly expressed in elongating root epidermis cells (Birnbaum et al, 2003). These double mutants showed normal gravitropism and auxin response in the primary root (not shown). Thus, ARF10 and ARF16 are unlikely to be targets of shy2-2 inhibition. The NPH4/ARF7 gene is required for shoot tropisms, but the nph4 mutant has no root gravitropism defect (Liscum and Briggs, 1996; Watahiki and Yamamoto, 1997; Tatematsu et al, 2004; Figure 6A). However, the ARF19 gene is highly related to NPH4 (Remington et al, 2004), and it has recently been shown that ARF19 acts redundantly with NPH4 in plant growth, including gravi- and phototropism in seedlings (Okushima et al, 2005). To test whether ARF19 regulates the same responses that are disturbed in shy2-2 mutants, two mutant alleles of ARF19 were tested. One of these, arf19-4, has a weak but significant phenotype in auxin-mediated root development. Gravitropic response as well as growth sensitivity to 2,4-D is impaired (Figure 6A and B). An nph4-1 arf19-4 double mutant, however, was severely impaired in gravitropism (Figure 6A) and also showed nearly complete auxin-resistant root growth (Figure 6B). Correspondingly, auxin-induced SHY2 gene expression was partially impaired in each single mutant, and nearly completely lost in the nph4-1 arf19-4 double mutant (Figure 6C). These results suggest that NPH4 and ARF19 act redundantly in auxin responses in the primary root tip, and are therefore good candidates for targets of inhibition by shy2-2. Figure 6.NPH4 and ARF19 as targets for shy2 inhibition in the root. (A) Gravitropic response of wild-type (COL), nph4-1, arf19-4 and nph4-1 arf19-4 seedling roots (numbers analyzed in parentheses) upon reorientation by 90°. (B) Inhibition of root growth by 2,4-D. Root length (±s.d.) was measured after 3 days of vertical growth on medium with (black bars) or without (white bars) 0.1 μM 2,4-D. Growth is represented as percentage of root length in wild type (COL) on control media. (C) SHY2 mRNA expression in COL, nph4-1, arf19-4 and nph4-1 arf19-4 seedlings treated with unsupplemented medium (white bars) or with medium containing 50 μM IAA (black bars) for 3 h. Average values (±s.d.) are taken from five to six replicate real-time PCR reactions (quantitative RT–PCR); inset: semiquantitative RT–PCR experiment on dissected roots from three replicates. Expression is relative to ACT2 expression in the same cDNA samples. (D) Interaction of SHY2 or BDL with MP and ARF19 in yeast two-hybrid assays. Galactosidase activity (±s.d.) was measured in at least 12 independent colonies expressing each of the depicted plasmids (−, empty vector control). Download figure Download PowerPoint Yeast two-hybrid assays were performed to test whether ARF7 and ARF19 can be targets for SHY2 action in the root, and whe

Abstract Plant cells can be distinguished from animal cells by their cell walls and high turgor pressure. Although changes in turgor and stiffness of cell walls seem coordinated, we know little about the mechanism responsible for coordination. Evidence has accumulated that plants, like yeast, have a dedicated cell wall integrity maintenance mechanism. This mechanism monitors the functional integrity of the wall and maintains it through adaptive responses when cell wall damage occurs during growth, development, and interactions with the environment. The adaptive responses include osmo-sensitive-induction of phytohormone production, defence responses as well as changes in cell wall composition and structure. Here, we investigate how the cell wall integrity maintenance mechanism coordinates changes in cell wall stiffness and turgor in Arabidopsis thaliana . We show that the production of abscisic acid (ABA), the phytohormone modulating turgor pressure and responses to drought, depends on the presence of a functional cell wall. We find that the cell wall integrity sensor THESEUS1 modulates mechanical properties of walls, turgor loss point and ABA biosynthesis. We identify RECEPTOR-LIKE PROTEIN 12 as a new component of cell wall integrity maintenance controlling cell wall damage-induced jasmonic acid production. Based on the results we propose that THE1 is responsible for coordinating changes in turgor pressure and cell wall stiffness. Significance statement Plants need to constantly adapt to a changing environment. This includes responses to biotic and abiotic stress. Key elements influencing the response to abiotic stress are the plant cell walls surrounding all cells and the phytohormone abscisic acid, which influences turgor pressure in plants. Turgor pressure in plant cells is much higher than in animal cells and a key driver of plant growth and development. Here we investigate the mechanism regulating cell wall stiffness and coordinating changes in stiffness and turgor. We characterize key elements of the mechanism and dissect its mode of action. This knowledge will enable us to pursue novel approaches to improve plant resistance to drought stress, which is crucial in a rapidly changing environment.

Plant cell walls participate in all plant-environment interactions. Maintaining cell wall integrity (CWI)during these interactions is essential. This realization led to increased interest in CWI and resulted in knowledge regarding early perception and signalling mechanisms active during CWI maintenance. By contrast, knowledge regarding processes mediating changes in cell wall metabolism upon CWI impairment is very limited. To identify genes involved and to investigate their contributions to the processes we selected 23 genes with altered expression in response to CWI impairment and characterized the impact of T-DNA insertions in these genes on cell wall composition using Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) in Arabidopsis thaliana seedlings. Insertions in 14 genes led to cell wall phenotypes detectable by FTIR. A detailed analysis of four genes found that their altered expression upon CWI impairment is dependent on THE1 activity, a key component of CWI maintenance. Phenotypic characterizations of insertion lines suggest that the four genes are required for particular aspects of CWI maintenance, cell wall composition or resistance to Plectosphaerella cucumerina infection in adult plants. Taken together, the results implicate the genes in responses to CWI impairment, cell wall metabolism and/or pathogen defence, thus identifying new molecular components and processes relevant for CWI maintenance.

Reactive oxygen species (ROS) are important messengers in eukaryotic organisms and their production is tightly controlled. Active extracellular ROS production by NADPH oxidases in plants is triggered by receptor-like protein kinase (RLK)-dependent signaling networks. Here we show that the cysteine-rich RLK CRK2 kinase activity is required for plant growth and CRK2 exists in a preformed complex with the NADPH oxidase RBOHD in Arabidopsis. Functional CRK2 is required for the full elicitor-induced ROS burst and consequently the crk2 mutant is impaired in defense against the bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv . tomato DC3000. Our work demonstrates that CRK2 regulates plant innate immunity. We identified in vitro CRK2-dependent phosphorylation sites in the C-terminal region of RBOHD. Phosphorylation of S703 RBOHD is enhanced upon flg22 treatment and substitution of S703 with alanine reduced ROS production in Arabidopsis. Phylogenetic analysis suggests that phospho-sites in C-terminal region of RBOHD are conserved throughout the plant lineage and between animals and plants. We propose that regulation of NADPH oxidase activity by phosphorylation of the C-terminal region might be an ancient mechanism and that CRK2 is an important element in regulating MAMP-triggered ROS production.One-sentence summary CRK2 associates with and activates RBOHD to trigger MAMP-induced ROS production and reveals a novel regulatory mechanism for plant NADPH oxidases through phosphorylation of the C-terminus.

During growth, development and defense, cell wall integrity needs to be coordinated with cell cycle activity. In Saccharomyces cerevisiae, coordination is mediated by the cell wall integrity maintenance mechanism. In plants, little is known how coordination is achieved. Here we investigated coordination between plant cell wall and cell cycle activity in Arabidopsis thaliana seedlings by studying the impact of cell wall damage (CWD, caused by cellulose biosynthesis inhibition) on cell cycle gene expression, growth, phytohormone (jasmonic acid, salicylic acid, cytokinins) and lignin accumulation. We found root growth and cell cycle gene expression are reduced by CWD in an osmo-sensitive manner. trans-zeatin application suppressed the CWD effect on gene expression. Quantification of cytokinins revealed CWD-induced, osmo-sensitive changes in several cytokinins. Expression of CYTOKININ OXIDASE2/DEHYDROGENASE (CKX2) and CKX3, encoding cytokinin-degrading enzymes, was elevated in CWD-exposed seedlings. Genetic studies implicated NITRATE REDUCTASE1/2 (NIA1/2) in the response to CWD. In nia1/2 seedlings CWD induced neither expression of CKX2/3 and cell cycle genes nor accumulation of jasmonic acid, salicylic acid and lignin. This suggests that CWD causes increased CKX2/3 expression through a NIA1/2-mediated process. Increased CKX expression seems to cause changes in cytokinin levels, leading to reduced cell cycle gene expression.

Plant cells are surrounded by walls, which must often meet opposing functional requirements during plant growth and defense. The cells meet them by modifying wall structure and composition in a tightly controlled and adaptive manner. The modifications seem to be mediated by a dedicated cell wall integrity (CWI) maintenance mechanism. Currently the mode of action of the mechanism is not understood and it is unclear how its activity is coordinated with established plant defense signaling. We investigated responses to induced cell wall damage (CWD) impairing CWI and the underlying mechanism in Arabidopsis thaliana. Interestingly inhibitor- and enzyme-derived CWD induced similar, turgor-sensitive stress responses. Genetic analysis showed that the receptor-like kinase (RLK) FEI2 and the mechano-sensitive, plasma membrane-localized Ca2+- channel MCA1 function downstream of the THE1 RLK in CWD perception. Phenotypic clustering with 27 genotypes identified a core group of RLKs and ion channels, required for activation of CWD responses. By contrast, the responses were repressed by pattern-triggered immune (PTI) signaling components including PEPR1 and 2, the receptors for the immune signaling peptide AtPep1. Interestingly AtPep1 application repressed CWD-induced phytohormone accumulation in a PEPR1/2-dependent manner. These results suggest that PTI suppresses CWD-induced defense responses through elicitor peptide-mediated signaling during defense response activation. If PTI is impaired, the suppression of CWD-induced responses is alleviated, thus compensating for defective PTI.