Natural interferon-producing cells (IPC) respond to viruses by secreting type I interferon (IFN) and interleukin-12 (IL-12). Toll-like receptor (TLR) 9 mediates IPC recognition of some of these viruses in vitro. However, whether TLR9-induced activation of IPC is necessary for an effective antiviral response in vivo is not clear. Here, we demonstrate that IPC and dendritic cells (DC) recognize murine cytomegalovirus (MCMV) through TLR9. TLR9-mediated cytokine secretion promotes viral clearance by NK cells that express the MCMV-specific receptor Ly49H. Although depletion of IPC leads to a drastic reduction of the IFN-α response, this allows other cell types to secrete IL-12, ensuring normal IFN-γ and NK cell responses to MCMV. We conclude that the TLR9/MyD88 pathway mediates antiviral cytokine responses by IPC, DC, and possibly other cell types, which are coordinated to promote effective NK cell function and MCMV clearance.

Summary

 Although activated murine NK cells can use the granule exocytosis pathway to kill target cells immediately upon recognition, resting murine NK cells are minimally cytotoxic for unknown reasons. Here, we showed that resting NK cells contained abundant granzyme A, but little granzyme B or perforin; in contrast, the mRNAs for all three genes were abundant. Cytokine-induced in vitro activation of NK cells resulted in potent cytotoxicity associated with a dramatic increase in granzyme B and perforin, but only minimal changes in mRNA abundance for these genes. The same pattern of regulation was found in vivo with murine cytomegalovirus infection as a physiologic model of NK cell activation. These data suggest that resting murine NK cells are minimally cytotoxic because of a block in perforin and granzyme B mRNA translation that is released by NK cell activation.

NKG2D is a key component of cytotoxic antitumor and antiviral responses. Multiple viruses evade NKG2D recognition by blocking NKG2D ligand expression on infected cells. In contrast, cowpox virus targets NKG2D directly by encoding a secreted antagonist, Orthopoxvirus MHC Class I-like Protein (OMCP). We have previously reported that OMCP also binds to the orphan receptor FcRL5 on innate B cells. Here, we demonstrate that mammalian-derived, glycosylated OMCP binds NKG2D but not FcRL5. Cowpox viruses either lacking OMCP, or expressing an NKG2D-binding deficient mutant, are significantly attenuated in wild type and FcRL5-deficient mice but not NKG2D-deficient mice, demonstrating that OMCP is critical in subverting NKG2D-mediated immunity in vivo. Next we determined the structure of OMCP bound to human NKG2D. Despite a structure similar to that of host NKG2D ligands, OMCP uses a drastically different orientation for NKG2D binding. The re-orientation of OMCP is associated with dramatically higher affinity for human NKG2D and the targeted interface is highly conserved in mammalian NKG2Ds, increasing the zoonotic potential of cowpox virus. We also show that cell surface presented OMCP can trigger NKG2D effector functions equivalently to host NKG2D ligands, demonstrating that NKG2D-mediated signaling requires clustering but is insensitive to binding orientation. Thus, in contrast to TCR/MHC interactions, the docking topology of NKG2D with its ligands does not appear to regulate its activation.