Sarcomeres are the basic contractile units within cardiac myocytes, and the collective shortening of sarcomeres aligned along myofibrils generates the force driving the heartbeat. The alignment of the individual sarcomeres is important for proper force generation, and misaligned sarcomeres are associated with diseases including cardiomyopathies and COVID-19. The actin bundling protein, α-actinin-2, localizes to the "Z-Bodies" of sarcomere precursors and the "Z-Lines" of sarcomeres, and has been used previously to assess sarcomere assembly and maintenance. Previous measurements of α-actinin-2 organization have been largely accomplished manually, which is time-consuming and has hampered research progress. Here, we introduce sarcApp, an image analysis tool that quantifies several components of the cardiac sarcomere and their alignment in muscle cells and tissue. We first developed sarcApp to utilize deep learning-based segmentation and real space quantification to measure α-actinin-2 structures and determine the organization of both precursors and sarcomeres/myofibrils. We then expanded sarcApp to analyze "M-Lines" using the localization of myomesin and a protein that connects the Z-Lines to the M-Line (titin). sarcApp produces 33 distinct measurements per cell and 24 per myofibril that allow for precise quantification of changes in sarcomeres, myofibrils, and their precursors. We validated this system with perturbations to sarcomere assembly. We found perturbations that affected Z-Lines and M-Lines differently, suggesting that they may be regulated independently during sarcomere assembly.

Forces generated by myofibrils within cardiomyocytes must be balanced by adhesion to the substrate and to other cardiomyocytes for proper heart function. Loss of this force balance results in cardiomyopathies that ultimately cause heart failure. How this force balance is first established during the assembly of myofibrils is poorly understood. Using human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes, we show coupling of focal adhesions to myofibrils during early steps of de novo myofibrillogenesis is essential for myofibril maturation. We also establish a key role for Focal adhesion kinase (FAK), a known regulator of adhesion dynamics in non-muscle cells, in regulating focal adhesion dynamics in cardiomyocytes. Specifically, FAK inhibition increased the stability of vinculin in focal adhesions, allowing greater substrate coupling of assembling myofibrils. Furthermore, this coupling is critical for regulating myofibril tension and viscosity. Taken together, our findings uncover a fundamental mechanism regulating the maturation of myofibrils in human cardiomyocytes.

The sarcomere is the basic contractile unit within cardiomyocytes driving heart muscle contraction. We sought to test the mechanisms regulating thin (i.e., actin) and thick (i.e., myosin) filament assembly during sarcomere formation. Thus, we developed an assay using human cardiomyocytes to test de novo sarcomere assembly. Using this assay, we report a population of muscle-specific stress fibers are essential sarcomere precursors. We show sarcomeric actin filaments arise directly from these muscle stress fibers. This process requires formin-mediated but not Arp2/3-mediated actin polymerization and non-muscle myosin IIB but not non-muscle myosin IIA. Furthermore, we show a short species of beta cardiac myosin II filaments grows to form 1.5 micron long filaments that then stitch together to form the stack of filaments at the core of the sarcomere (i.e., A-band). Interestingly, these are different from mechanisms that have previously been reported during stress fiber assembly in non-muscle cells. Thus, we provide a new model of cardiac sarcomere assembly based on distinct mechanisms of stress fiber regulation between non-muscle and muscle cells.

The mechanical properties of the cellular cortex regulate shape changes during cell division, cell migration and tissue morphogenesis. During cell division, contractile force generated by the molecular motor myosin II (MII) at the equatorial cortex drives cleavage furrow ingression. Cleavage furrow ingression in turn increases stresses at the polar cortex, where contractility must be regulated to maintain cell shape during cytokinesis. How polar cortex contractility controls cell shape is poorly understood. We show a balance between MII paralogs allows a fine-tuning of cortex tension at the polar cortex to maintain cell shape during cytokinesis, with MIIA driving cleavage furrow ingression and bleb formation, and MIIB serving as a stabilizing motor and mediating completion of cytokinesis. As the majority of non-muscle contractile systems are cortical, this tuning mechanism will likely be applicable to numerous processes driven by MII contractility.

MCL-1 is a well-characterized inhibitor of cell death that has also been shown to be a regulator of mitochondrial dynamics in human pluripotent stem cells (hPSCs). We used cardiomyocytes derived from hPSCs (hPSC-CMs) to uncover whether MCL-1 is crucial for cardiac function and survival. Inhibition of MCL-1 by BH3 mimetics resulted in the disruption of mitochondrial morphology and dynamics as well as disorganization of the actin cytoskeleton. Interfering with MCL-1 function affects the homeostatic proximity of DRP-1 and MCL-1 at the outer mitochondrial membrane, resulting in decreased functionality of hPSC-CMs. BH3 mimetics targeting MCL-1 are promising anti-tumor therapeutics. Cardiomyocytes display abnormal functional cardiac performance even after caspase inhibition, supporting a non-apoptotic activity of MCL-1 in hPSC-CMs. Progression towards using BCL-2 family inhibitors, especially targeting MCL-1, depends on understanding not only its canonical function in preventing apoptosis, but also in the maintenance of mitochondrial dynamics and function.