Group A Streptococcus (GAS) is a human pathogen that causes infections ranging from mild to fulminant and life-threatening. Biofilms have been implicated in acute GAS soft-tissue infections such as necrotizing fasciitis (NF). However, most in vitro models used to study GAS biofilms have been designed to mimic chronic infections and insufficiently recapitulate in vivo conditions and the host-pathogen interactions that might influence biofilm formation. Here we establish and characterize an in vitro model of GAS biofilm development on mammalian cells that simulates microcolony formation observed in a murine model of human NF. We show that on mammalian cells, GAS forms dense aggregates that display hallmark biofilm characteristics including a three-dimensional architecture and enhanced tolerance to antibiotics. In contrast to abiotic-grown biofilms, host-associated biofilms require the expression of secreted GAS streptolysins O and S (SLO, SLS) resulting in the release of a host-associated biofilm promoting-factor(s). Supernatants from GAS-infected mammalian cells or from cells treated with endoplasmic reticulum (ER) stressors restore biofilm formation to an SLO and SLS null mutant that is otherwise attenuated in biofilm formation on cells, together suggesting a role for streptolysin-induced ER stress in this process. In an in vivo mouse model, the streptolysin-null mutant is attenuated in both microcolony formation and bacterial spread, but pre-treatment of soft-tissue with an ER-stressor restores the ability of the mutant to form wild type like microcolonies that disseminate throughout the soft tissue. Taken together, we have identified a new role of streptolysin-driven ER stress in GAS biofilm formation and NF disease progression.

Streptococcus (GAS) is a highly adapted and human-restricted pathogen causing a wide variety of infections, some life-threatening1. This ability is linked to the expression of many virulence factors, whose transcription is regulated by the two-component system, CovR/S2-5. Here, we show that genome transcription of GAS cultured in a chemically defined medium (CDM) is globally affected when supplemented with asparagine (Asn), including increased expression of many virulence genes. For the first time, we report that GAS solely depends on asparagine synthetase (AsnA) for Asn synthesis, on the ABC transporter (GlnPQ) to import Asn, and on the asparaginase (AsnB) to maintain a precisely balanced intracellular Asn concentration. Furthermore, we show that mutants defective in either asnA, glnP, or asnB express significantly lower levels of virulence factors in CDM and are severely attenuated in the sublethal murine model of human GAS soft-tissue infection. We further show that the synthesis and import of Asn in GAS are ATP-dependent processes and are negatively regulated by intracellular Asn. Thus, Asn availability controls the intracellular ATP level. When ATP becomes limiting, CovR phosphorylation decreases. This augments GAS growth rate, virulence production, metabolism, and vice versa when the ATP level increases. Furthermore, excess Asn accumulates inside GAS in AsnB mutant, destroying the balance between Asn and ATP. We discuss the high similarity between these mechanistic principles of the Asn-mediated control of GAS virulence and metabolism to the Asn-mediated control of tumor growth6, indicating evolutionary significance.

ABSTRACT GBS may cause a devasting disease in newborns. In early onset disease of the newborn the bacteria are acquired from the colonized mother during delivery. We characterized type VII secretion system (T7SS), exporting small proteins of the WXG100 superfamily, in group B Streptococci (GBS) isolates from pregnant colonized women and newborns with early onset disease (EOD) to understand better understand T7SS contribution to virulence in these different clinical scenarios. GBS isolates were obtained from colonized mother prior to delivery and from newborns with EOD. DNA was analyzed for T7SS genes. A mutant EOD strain (ST17) was created by knocking out the essC gene encoding a T7SS protein. Galleria mellonella larvae were used to compare virulence of colonizing, EOD, and mutant EOD isolates. 33 GBS genomes were tested, 17 EOD isolates and 16 colonizing isolates. The T7SS locus encoded 8 genes: essC , membrane-embedded proteins ( essA; essB ), modulators of T7SS activity (esaA; esaB; esaC ) and effectors: [ esxA (SAG1039); esxB (SAG1030). ST17 isolates encode two copies of the essC gene and esxA gene encoding putative effectors but were present only in 23.5% of isolates. In ST1 isolates three copies of esxA gene were identified, but in ST6 and ST19 isolates all T7SS genes were missing. EOD isolates demonstrated enhanced virulence in G. mellonella model compared to colonizing isolates. The 118659Δ essC strain was attenuated in its killing ability, and the larvae were more effective in eradicating 118659Δ essC infection. essC gene deletion was associated with reduced bacterial growth. We demonstrated that T7SS plays an essential role during infection and contributes to GBS pathogenicity. Author Summary Type VII secretion system (T7SS) is related to virulence in various bacteria but is not well characterized in Group B Streptococci (GBS). GBS may cause sepsis, meningitis, and death in newborns. The bacteria rarely cause disease in pregnant mothers. Newborns acquire GBS from the colonized mother during delivery. We studied the role of T7SS in GBS isolates obtained from newborns with GBS sepsis in the first week of life and in colonized pregnant mothers. By studying T7SS genes we discovered that the genetic structure of the T7SS differs between isolates causing severe disease and colonizing isolates. To study the virulence of different GBS isolates we injected them into larvae and monitored larvae survival. Isolates causing severe disease in the newborn caused a more severe disease in larvae compared to colonizing isolates. We then deleted T7SS genes in GBS isolates causing severe disease. The killing activity of GBS isolates without T7SS genes was attenuated. The larva responded to these bacteria similarly to the response found when injecting the larva with GBS isolates from colonized mothers. These results support our hypothesis that T7SS is important for causing severe infection in the newborn and that this system contributes to GBS pathogenicity.