Abstract The nuclear receptor Nr2f1 plays a key role during cortical development by acting as a strong transcriptional regulator in embryonic and postnatal neural cells. In humans, its mutations cause the Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy-intellectual syndrome (BBSOAS), a rare neurodevelopmental disorder characterized by multiple clinical features including optic nerve atrophy, intellectual disability, and autistic traits. In this study by genome-wide and in silico analyses we found that key factors for mitochondrial function and dynamics represent potential genomic targets under direct Nr2f1 transcriptional control in neurons. Although mitochondrial dysfunction is increasingly implicated in neurodevelopmental disorders, whether and how Nr2f1 can regulate mitochondria function in neural cells is still completely unknown. To address these questions, we have combined mouse genetics, neuroanatomical and imaging approaches. To genetically manipulate Nr2f1 function in newborn neurons we focused on the adult mouse hippocampal dentate gyrus, a site of persistent neurogenesis where Nr2f1 is highly expressed. We showed that conditional Nr2f1 loss-of-function within the hippocampal neurogenic niche lead to a reduced mitochondrial mass associated to mitochondrial fragmentation in newborn neurons, likely reflecting alteration in mitochondrial dynamics. Accordingly, we showed that the fusion factor Mfn2, which is as a putative Nr2f1 target, is downregulated following both Nr2f1 adult depletion and embryonic haploinsufficiency in mice. Overall, our study provides the first evidence of a crucial role of Nr2f1 in shaping mitochondria in neurons and opens a promising avenue for the identification of new mechanisms implicated in BBSOAS pathogenesis involving mitochondrial dysfunction.

Abstract Genomic sequence mutations in both the germline and somatic cells can be pathogenic. Several authors have observed that often the same genes are involved in cancer when mutated in somatic cells and in genetic diseases when mutated in the germline. Recent advances in high-throughput sequencing techniques have provided us with large databases of both types of mutations, allowing us to investigate this issue in a systematic way. Here we show that high-throughput data about the frequency of somatic mutations in the most common cancers can be used to predict the genes involved in abnormal phenotypes and diseases. The predictive power of somatic mutation patterns is largely independent of that of methods based on germline mutation frequency, so that they can be fruitfully integrated into algorithms for the prioritization of causal variants. Our results confirm the deep relationship between pathogenic mutations in somatic and germline cells, provide new insight into the common origin of cancer and genetic diseases and can be used to improve the identification of new disease genes.

Genome expansion is believed to be an important driver of the evolution of gene regulation. To investigate the role of newly arising sequence in rewiring the regulatory network we estimated the age of each region of the human genome by applying maximum parsimony to genome-wide alignments with 100 vertebrates. We then studied the age distribution of several types of functional regions, with a focus on regulatory elements. The age distribution of regulatory elements reveals the extensive use of newly formed genomic sequence in the evolution of regulatory interactions. Many transcription factors have expanded their repertoire of targets through waves of genomic expansions that can be traced to specific evolutionary times. Repeated elements contributed a major part of such expansion: many classes of such elements are enriched in binding sites of one or a few specific transcription factors, whose binding sites are localized in specific portions of the element and characterized by distinctive motif words. These features suggest that the binding sites were available as soon as the new sequence entered the genome, rather than being created later by accumulation of point mutations. By comparing the age of regulatory regions to the evolutionary shift in expression of nearby genes we show that rewiring through genome expansion played an important role in shaping the human regulatory network.

Breast cancer is a complex disease in which heterogeneity makes clinical management very challenging. Although breast cancer subtypes classified according to specific molecular features are associated to better or worse prognosis, the identification of specific markers predicting disease outcome within the single subtypes still lags behind. Both the non-canonical WNT and the STAT3 pathways are often constitutively activated in breast tumors, and both can induce the small GTPase RhoU gene transcription. Here we show that RhoU transcription can be triggered by both canonical and non-canonical WNT ligands via the activation of JNK and the recruitment of the SP1 transcription factor to the RhoU promoter, identifying for the first time SP1 as a JNK-dependent mediator of WNT signaling. RhoU down-regulation by silencing or treatment with JNK, SP1 or STAT3 inhibitors lead to impaired cell migration in basal-like MDA-MB-231 cells, which display constitutive activation of both the non-canonical WNT and STAT3 pathways. These data suggest that STAT3 and SP1 can cooperate to induce high RhoU expression and enhance migration of breast cancer cells. In vivo binding of both factors characterizes a group of SP1/STAT3 responsive genes belonging to the non-canonical WNT and the IL-6/STAT3 pathways. High expression of this signature is significantly correlated with poor prognosis across all profiled patients. Thus, concomitant binding of both STAT3 and SP1 defines a subclass of genes contributing to breast cancer aggressiveness, suggesting the relevance of developing novel targeted therapies combining inhibitors of the STAT3 and WNT pathways or of their downstream mediators.

1. Abstract Long non-coding RNAs (lncRNAs) regulate gene expression through different molecular mechanisms, including DNA binding. We curated the first database of RNA Binding Sites (RNABSdb) by harmonising publicly available raw-data of RNA-DNA binding experiments. This resource is crucial to enable systematic studies on transcriptional regulation driven by lncRNAs. Focusing on high quality experiments, we find that the number of binding sites for each lncRNAs varies from hundreds to tens of thousands. Despite being poorly characterised, the formation of RNA:DNA:DNA triple helices (TPXs) is one of the molecular mechanisms that allows lncRNAs to bind the genome and regulate gene expression. We developed 3plex, a software able to predict TPXs in silico . We show that 3plex outperforms previous existing approaches leveraging the data collected in RNABSdb for lncRNAs known to form functional TPXs. Moreover this analysis shows that TPXs tend to be shorter and more degenerated than previously expected. Finally, we applied 3plex to all the lncRNAs collected in RNABSdb and we show that the majority of them could directly bind the genome by TPXs formation. Data and software are available at https://molinerislab.github.io/RNABSdb/ and https://github.com/molinerisLab/3plex .

A bstract Patient-derived xenografts (PDXs) are tumour fragments engrafted into mice for preclinical studies. PDXs offer clear advantages over simpler in vitro cancer models - such as cancer cell lines (CCLs) and organoids - in terms of structural complexity, heterogeneity, and stromal interactions. We characterised 231 colorectal cancer PDXs at the genomic, transcriptomic, and epigenetic level and measured their response to cetuximab, an EGFR inhibitor in clinical use for metastatic colorectal cancer. After assessing PDXs’ quality, stability, and molecular concordance with publicly available patient cohorts, we trained, interpreted, and validated an integrated ensemble classifier (CeSta) which takes in input the PDXs’ multi-omic characterisation and predicts their sensitivity to cetuximab treatment (AUROC > 0.9). Our study shows that large PDX collections can be used to train accurate, interpretable models of drug sensitivity, which 1) better recapitulate patient-derived therapeutic biomarkers than other models trained on CCL data, 2) can be robustly validated across independent PDX cohorts, and 3) can be used for the development of novel therapeutic biomarkers.

Haemophilia A (HA) is a rare bleeding disorder caused by factor 8 (F8) mutations. Clinical manifestations are spontaneous bleedings that primarily consist of hemarthrosis and intracranial haemorrhages. To date, the impairment of vessel stability in HA patients and the correlation between FVIII and endothelial functionality is poorly understood. Here we show that FVIII plays a role in endothelial cell functionality. Blood Outgrowth endothelial cells (BOECs) knockout generated by CRISPR/Cas9, HA BOECs and HA iPSCs-derived ECs showed alteration of vessel-formation, endothelial cell migration, and vessel permeability. Importantly, the impaired EC phenotype was rescued by treatment with recombinant human FVIII or by lentiviral vector (LV) expressing FVIII. The FVIII function on endothelium was confirmed in vivo in a mouse model of severe HA which showed that an altered angiogenesis and vessel permeability could be treated by exogenous FVIII. BOECs transcriptomic profiles revealed that FVIII regulates the expression of endothelial basement membrane and extracellular matrix genes. Furthermore, exogenous expression of Nidogen2, identified as a FVIII regulated gene, restored the extracellular matrix integrity and EC functionality of HA ECs. In conclusion, FVIII is not only a coagulation factor but also an endothelial cell autocrine factor which promotes vessel stability.

The high-grade serous ovarian cancer (HG-SOC) tumor microenvironment (TME) is constellated by cellular elements and a network of soluble constituents that contribute to tumor progression. In the multitude of the secreted molecules, the endothelin-1 (ET-1) has emerged to be implicated in the tumor/TME interplay; however, the molecular mechanisms induced by the ET-1-driven feed-forward loops (FFL) and associated with the HG-SOC metastatic potential need to be further investigated. The tracking of the patient-derived (PD) HG-SOC cell transcriptome by RNA-seq identified the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene and its associated signature among those mostly up-regulated by ET-1 and down-modulated by the dual ET-1R antagonist macitentan. Within the ligand-receptor pairs concurrently expressed in PD-HG-SOC cells, endothelial cells and activated fibroblasts, we discovered two intertwined FFL, the ET-1/ET-1R and VEGF/VEGF receptors, concurrently activated by ET-1 and shutting-down by macitentan, or by the anti-VEGF antibody bevacizumab. In parallel, we observed that ET-1 fine-tuned the tumoral and stromal secretome toward a pro-invasive pattern. Into the fray of the HG-SOC/TME double and triple co-cultures, the secretion of ET-1 and VEGF, that share a common co-regulation, was inhibited upon the administration of macitentan. Functionally, macitentan, mimicking the effect of bevacizumab, interfered with the HG-SOC/TME FFL-driven communication that fuels the HG-SOC invasive behavior. The identification of ET-1 and VEGF FFL as tumor and TME actionable vulnerabilities, reveals how ET-1R blockade, targeting the HG-SOC cells and the TME simultaneously, may represent an effective therapeutic option for HG-SOC patients.