Abstract Introduction Smooth muscle cells (SMC) play a critical role in atherosclerosis. The Aryl hydrocarbon receptor (AHR) is an environment-sensing transcription factor that contributes to vascular development, and has been implicated in coronary artery disease (CAD) risk. We hypothesized that AHR can affect atherosclerosis by regulating phenotypic modulation of SMC. Methods We combined RNA-Seq, ChIP-Seq, ATAC-Seq and in-vitro assays in human coronary artery SMC (HCASMC), with single-cell RNA-Seq (scRNA-Seq), histology, and RNAscope in an SMC-specific lineage-tracing Ahr knockout mouse model of atherosclerosis to better understand the role of AHR in vascular disease. Results Genomic studies coupled with functional assays in cultured HCASMC revealed that AHR modulates HCASMC phenotype and suppresses ossification in these cells. Lineage tracing and activity tracing studies in the mouse aortic sinus showed that the Ahr pathway is active in modulated SMC in the atherosclerotic lesion cap. Furthermore, scRNA-Seq studies of the SMC-specific Ahr knockout mice showed a significant increase in the proportion of modulated SMC expressing chondrocyte markers such as Col2a1 and Alpl , which localized to the lesion neointima. These cells, which we term “chondromyocytes” (CMC), were also identified in the neointima of human coronary arteries. In histological analyses, these changes manifested as larger lesion size, increased lineage-traced SMC participation in the lesion, decreased lineage-traced SMC in the lesion cap, and increased alkaline phosphatase activity in lesions in the Ahr knockout compared to wild-type mice. We propose that AHR is likely protective based on these data and inference from human genetic analyses. Conclusion Overall, we conclude that AHR promotes maintenance of lesion cap integrity and diminishes the disease related SMC-to-CMC transition in atherosclerotic tissues.

Abstract Background To investigate the epigenetic and transcriptional mechanisms of coronary artery disease (CAD) risk, as well as the functional regulation of chromatin structure and function, we have created a catalog of genetic variants associated with three stages of transcriptional cis -regulation in primary human coronary artery vascular smooth muscle cells (HCASMC). Results To this end, we have used a pooling approach with HCASMC lines to map regulatory variation that mediates binding of the CAD associated transcription factor TCF21 with ChIPseq studies (bQTLs), variation that regulates chromatin accessibility with ATACseq studies (caQTLs), and chromosomal looping with HiC methods (clQTLs). We show significant overlap of the QTLs, and their relationship to smooth muscle specific genes and the binding of smooth muscle transcription factors. Further, we use multiple analyses to show that these QTLs are highly associated with CAD GWAS loci and correlated to lead SNPs in these loci where they show allelic effects. We have verified with genome editing that identified functional variants can regulate both chromatin accessibility and chromosomal looping, providing new insights into functional mechanisms regulating chromatin state and chromosomal structure. Finally, we directly link the disease associated TGFβ1-SMAD3 pathway to the CAD associated FN1 gene through a response QTL that modulates both chromatin accessibility and chromosomal looping. Conclusions Together, these studies represent the most thorough mapping of multiple QTL types in a highly disease relevant primary cultured cell type, and provide novel insights into their functional overlap and mechanisms that underlie these genomic features and their relationship to disease risk.

Platelet derived growth factor (PDGF) signaling has been extensively studied in the context of vascular disease, but the genetics of this pathway remain to be established. Genome wide association studies (GWAS) for coronary artery disease (CAD) have identified a risk locus at 11q22.3, and we have verified with fine mapping approaches that the regulatory variant rs2019090 and PDGFD represent the functional variant and putative functional gene. Further, FOXC1/C2 transcription factor (TF) binding at rs2019090 was found to promote PDGFD transcription through the CAD promoting allele. Employing a constitutive Pdgfd knockout allele along with SMC lineage tracing in a male atherosclerosis mouse model we mapped single cell transcriptomic, cell state, and lesion anatomical changes associated with gene loss. These studies revealed that Pdgfd promotes expansion, migration, and transition of SMC lineage cells to the chondromyocyte phenotype and vascular calcification. This is in contrast to protective CAD genes TCF21, ZEB2, and SMAD3 which we have shown to promote the fibroblast-like cell transition or perturb the pattern or extent of transition to the chondromyocyte phenotype. Further, Pdgfd expressing fibroblasts and pericytes exhibited greater expression of chemokines and leukocyte adhesion molecules, consistent with observed increased macrophage recruitment to the plaque. Despite these changes there was no effect of Pdgfd deletion on SMC contribution to the fibrous cap or overall lesion burden. These findings suggest that PDGFD mediates CAD risk through promoting SMC expansion and migration, in conjunction with deleterious phenotypic changes, and through promoting an inflammatory response that is primarily focused in the adventitia where it contributes to leukocyte trafficking to the diseased vessel wall.

Abstract Rationale Vascular beds have distinct susceptibility to atherosclerosis and aneurysm, yet the biological underpinnings of vascular bed specific disease risk are largely unknown. Vascular tissues have different developmental origins which may influence global chromatin accessibility. Understanding chromatin accessibility and gene expression profiles on single cell resolution is crucial to gain insight into vascular bed specific disease risk. Objective We aim to understand, at single cell resolution, the global chromatin accessibility and gene expression profiles across distinct vascular beds in the healthy adult mouse to provide insight into the potential mechanisms of vascular bed specific disease risk. Methods and Results We performed single cell chromatin accessibility (scATACseq) and gene expression profiling (scRNAseq) of healthy adult mouse vascular tissue from three vascular beds, 1) aortic root and ascending aorta, 2) brachiocephalic and carotid artery, and 3) descending thoracic aorta. By integrating datasets and comparing vascular beds within cell type, we identified thousands of differentially accessible chromatin peaks within smooth muscle cells, fibroblasts, and endothelial cells, demonstrating numerous enhancers to be vascular bed specific. We revealed an epigenetic ‘memory’ of embryonic origin with differential chromatin accessibility of key developmental transcription factors such as Tbx20 , Hand2 , Gata4 , and Hoxb family members. Increased transcription factor motif accessibility in ascending fibroblasts compared to descending further highlights SMAD2/3 functions and suggests a differential susceptibility to TGFβ. By isolating primary adventitial fibroblasts from ascending and descending thoracic aorta from adult mice, we demonstrate ascending fibroblasts to have a distinctly higher transcriptional response to TGFβ compared to descending fibroblasts, highlighting that distinct chromatin accessibility between vascular beds is retained following primary in vitro culture and influences responsiveness to disease relevant signaling. Conclusions This work supports a paradigm that the epigenomic and transcriptional landscapes of vascular cells are cell type and vascular bed specific and that differentially accessible regions are enriched for disease risk genes.

Long noncoding RNAs (lncRNA) comprise an underlying regulatory network in the human genome that remains largely unexplored and could represent a molecular mechanism connecting GWAS risk variants with the disease causal genes. Human coronary artery smooth muscle cells (HCASMC) are one of the most important cells in the regulation of atherosclerotic disease progression. In this study, we aimed to discover the HCASMC-specific lncRNA collection and to explore the mechanistic relationship between HCAMSC lncRNAs with increased disease risk for coronary artery disease. We applied 6 different stimuli relevant to athero-condition, including stimulations with TGFbeta, TNFalpha, PDGFD and serum, and two transcription factor knock-downs TCF21 and SMAD3, and performed deep RNA sequencing on 48 HCASMC samples. We designed a lncRNA discovery pipeline to maximize the detection of tissue specific and low expressed lncRNAs. This generated a set of 53076 lncRNAs, that showed increased association with CAD GWAS variants, various HCASMC eQTL data sets and GTEx eQTLs for tissues enriched in smooth muscle. Module analysis revealed lncRNAs highly associated with TGFbeta and general pro-differentiation traits located in the CAD GWAS loci, such as, FES/FURIN, COL4A1/A2, CDKN2A/B, TGFB1, and FN1. Transcription factor motif analysis revealed the presence of HCASMC relevant factors, such as, TCF21, ZEB1, ZEB2, JUN, JUND, and an SRF cofactor ELK4, near the boundaries of HCASMC lncRNA. We defined lncRNA QTLs using the GTEx Coronary Artery dataset, and showed colocalization with other HCASMC QTLs, such as expression QTLs, chromatin looping QTLs, chromatin accessibility QTLs and TCF21 binding QTLs. We show several examples of CAD GWAS loci where lncRNAs show regulatory function, such as FES/FURIN, FN1, COL4A1/A2 and TGFB1. We unraveled a complex network of regulatory interactions at FES/FURIN locus, involving TCF21 and lncRNA 43779.9, and present a model in which TCF21 inhibited lncRNA 43779.9 regulates FES gene and indirectly the pro-differentiation FURIN gene by creating a looping interaction with the intron 1 of FES transcript. We define 5 regulatory variants at the FES/FURIN locus and propose a causal variant, rs35346340, that disrupts TCF21 binding and subsequently influences 43779.9 expression. Finally, we show the presence of lncRNAs in deeply sequenced TCF21 pooled ChIPSeq and discover TCF21 binding lncRNAs, 3938.1 and 3852.1 as ACTA2-regulating transcripts. This study defines lncRNAs as essential regulators of GWAS loci and shows the importance of using deep sequencing approach to further explore the genomic regulatory landscape of lncRNAs in human tissues.