ABSTRACT The capacity of humoral B cell-mediated immunity to effectively respond to and protect against pathogenic infections is largely driven by the presence of a diverse repertoire of polyclonal antibodies in the serum, which are produced by plasma cells (PCs). 1,2 Recent studies have started to reveal the balance between deterministic mechanisms and stochasticity of antibody repertoires on a genotypic level (i.e., clonal diversity, somatic hypermutation, germline gene usage). 3–8 However, it remains unclear if clonal selection and expansion of PCs follows any deterministic rules or is stochastic with regards to phenotypic antibody properties (i.e., antigen-binding, affinity, epitope specificity). Here we report on the in-depth genotypic and phenotypic characterization of clonally expanded PC antibody repertoires following protein immunization. We find that there is only a strong correlation with antigen-specificity among the most expanded clones (top ~ 10), whereas among the rest of the clonal repertoire antigen-specificity is stochastic. Furthermore, we report both on a polyclonal repertoire and clonal lineage level that antibody-antigen binding affinity does not correlate with clonal expansion or somatic hypermutation. Lastly, we provide evidence for convergence towards dominant epitopes despite clonal sequence diversity among the most expanded clones. Our results highlight the extent to which clonal expansion can be ascribed to antigen binding, affinity and epitope specificity and they have implications for the assessment of effective vaccines. Graphical abstract

ABSTRACT Isolation and characterization of antibodies in COVID-19 patients has largely focused on memory B cells, however it is the antibody-secreting plasma cells that are directly responsible for the production of serum antibodies, which play a critical role in controlling and resolving SARS-CoV-2 infection. To date there is little known about the specificity of plasma cells in COVID-19 patients. This is largely because plasma cells lack surface antibody expression, which complicates their screening. Here, we describe a technology pipeline that integrates single-cell antibody repertoire sequencing and high-throughput mammalian display screening to interrogate the specificity of plasma cells from 16 convalescent COVID-19 patients. Single-cell sequencing allows us to profile antibody repertoire features in these patients and identify highly expanded clonal lineages. Mammalian display screening is employed to reveal that 37 antibodies (out of 132 candidates) derived from expanded plasma cell clonal lineages are specific for SARS-CoV-2 antigens, including antibodies that target the receptor binding domain (RBD) with high affinity and exhibit potent neutralization of SARS-CoV-2. One Sentence Summary Single-cell antibody repertoire sequencing and high-throughput screening identifies highly expanded plasma cells from convalescent COVID-19 patients that produce SARS-CoV-2-specific antibodies capable of potent neutralization.

Chimeric antigen receptors (CARs) consist of an extracellular antigen-binding region fused to intracellular signaling domains, thus enabling customized T cell responses against target cells. Due to the low-throughput process of systematically designing and functionally testing CARs, only a small set of immune signaling domains have been thoroughly explored, despite their major role in T cell activation, effector function and persistence. Here, we present speedingCARs, an integrated method for engineering CAR T cells by signaling domain shuffling and functional screening by single-cell sequencing. Leveraging the inherent modularity of natural signaling domains, we generated a diverse library of 180 unique CAR variants, which were genomically integrated into primary human T cells by CRISPR-Cas9. Functional and pooled screening of the CAR T cell library was performed by co-culture with tumor cells, followed by single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and single-cell CAR sequencing (scCAR-seq), thus enabling high-throughput profiling of multi-dimensional cellular responses. This led to the discovery of several CAR variants that retained the ability to kill tumor cells, while also displaying diverse transcriptional signatures and T cell phenotypes. In summary, speedingCARs substantially expands and characterizes the signaling domain combinations suited for CAR design and supports the engineering of next-generation T cell therapies.

CAR T-cell therapy is constrained by on-target, off-tumor toxicities as well as cellular exhaustion due to chronic antigen exposure. CARs comprising small-molecule controlled switches can enhance both safety and therapeutic efficacy but are limited by the scarcity of non-immunogenic protein elements responsive to non-immunosuppressive, clinically approved drugs with favorable pharmacodynamics. Here, we combine rational design and library-based optimization of a protein-protein interaction (PPI) of human origin to develop venetoclax-controlled Drug-Regulated Off-switch PPI (DROP)-CARs. DROP-CARs enable dose-dependent release of the tumor-targeting scFv and consequent T-cell dissociation from the target tumor cell. Additionally, we present proof-of-concept for a dual DROP-CAR controlled by different small molecules, as well as for logic-gated synthetic receptors enabling logic-gated STAT3 signaling. We demonstrate in vitro and in vivo function of DROP-CAR T cells and conclude that the approach holds important promise for clinical application.

The global dissemination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is associated with the emergence and establishment of clones in specific geographic areas. The Chilean-Cordobes clone (ChC) (ST5-SCC mec I) has been the predominant MRSA clone in Chile since its first description in 1998, despite the report of other emerging MRSA clones in the last years. Here, we characterize the evolutionary history of MRSA from 2000 to 2016 in a Chilean tertiary healthcare center using phylogenomic analyses. We sequenced 469 MRSA isolates collected between 2000-2016 in a tertiary healthcare center in Chile. We evaluated the temporal trends of the circulating clones and performed a phylogenomic reconstruction to characterize the clonal dynamics. We found a significant increase in the diversity and richness of sequence types (STs; Spearman r=0.8748, p<0.0001) with a Shannon diversity index increasing from 0.221 in the year 2000 to 1.33 in 2016. The temporal trend analysis revealed that in the period 2000-2003 most of the isolates (94.2%; n=98) belonged to the ChC clone. However, since then, the frequency of the ChC clone has decreased over time, accounting for 52% of the collection in the 2013-2016 period. This decline was accompanied by the rise of two emerging MRSA lineages, ST105-SCC mec II and ST72-SCC mec VI. In conclusion, the ChC clone remains the most frequent MRSA lineage in Chile. However, this lineage is gradually being replaced by several emerging clones, the most important of which is clone ST105-SCC mec II. To the best of our knowledge, this is the largest study of MRSA clonal dynamics performed in South America.Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a major public health pathogen that disseminates through the emergence of successful dominant clones in specific geographic regions. Knowledge of the dissemination and molecular epidemiology of MRSA in Latin America is scarce and is largely based on small studies or classical typing techniques with several limitations to depict an accurate description of their genomic landscape. We used whole-genome sequencing to study 469 MRSA isolates collected between 2000-2016 in Chile to provide the largest and most detailed study of clonal dynamics of MRSA carried out in South America to date. We found a significant increase in the diversity of MRSA clones circulating over the 17-year study period. Additionally, we describe the emergence of two novel clones (ST105-SCCmecII and ST72-SCCmecVI), which have been gradually increasing their frequency over time. Our results drastically improve our understanding of the dissemination and update our knowledge about MRSA in Latin America.

ABSTRACT Adoptive cell therapy of donor-derived, antigen-specific T cells expressing native T cell receptors (TCRs) is a powerful strategy to fight viral infections in immunocompromised patients. Determining the fate of T cells following patient infusion hinges on the ability to track them in vivo . While this is possible by genetic labeling of parent cells, the applicability of this approach has been limited by the non-specificity of the edited T cells. Here, we devised a method for CRISPR-targeted genome integration of a barcoded gene into Epstein-Barr virus-antigen-stimulated T cells and demonstrated its use for exclusively identifying expanded virus-specific cell lineages. Our method facilitated the enrichment of antigen-specific T cells, which then mediated improved cytotoxicity against EBV-transformed target cells. Single-cell and deep sequencing for lineage tracing revealed the expansion profile of specific T cell clones and their corresponding gene expression signature. This method has the potential to enhance the traceability and the monitoring capabilities during immunotherapeutic T cell regimens.

ABSTRACT Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have advanced substantially in the clinic for cancer immunotherapy. However, challenges related to safety persist; one major concern is when CARs respond to antigen present on healthy cells (on-target, off-tumour response). A strategy to ameliorate this consists in engineering the affinity of CARs such that they are only activated by tumor cells expressing high antigen levels. Here, we developed a CAR T cell display platform for functional screening based on cell signaling. Starting with a CAR with high affinity towards its target antigen, we used CRISPR-Cas9 genome editing to generate a library of antigen-binding domain variants. Following multiple rounds of functional screening and deep sequencing-guided selection, CAR variants were identified that were discriminatively activated by tumor cells based on antigen expression levels. Our platform demonstrates how directed evolution based on functional screening can be used to enhance the selectivity and safety of CARs.