Abstract Neurogenesis in the hypothalamus upon high fat diet (HFD) feeding regulates the feeding circuit. HFD induces the neurogenesis of β2 tanycytes in young-adult mice. However molecular mechanisms of tanycytic neurogenesis; and their functional integration into the feeding circuitry are poorly understood. We investigated the role of miRNAs in the regulation of HFD-induced tanycytic neurogenesis. miRNA arrays identified a cohort of HFD-induced, differentially-regulated miRNAs in BrdU + β2-tanycytes. These miRNAs arise from different chromosomes, rather than a single cluster. In silico network analysis on the predicted targets of all five HFD-induced miRNAs and reporter assays identified a subset of targets that influence neurogenesis and neuronal differentiation. HFD-induced miRNAs drive a molecular program leading to the functional integration of nascent neurons; introduction of a miRNA sponge sequestering all five miRNAs abolishes it. Diet-regulated newborn neurons preferentially differentiate into AgRP+ neurons that functionally integrate into the feeding circuit.

Homeostatic scaling in neurons involve substantial proteome remodelling. Although dynamic changes to the proteome have been attributed to either translational or degradative control individually, there remains a lack of insight towards understanding how the interplay between translation and degradation modules effectuate cellular proteostasis during scaling. Here, we report that a mutual co-dependence of the two apparatus drive synaptic homeostasis in an RNA-dependent manner. We observed that abrogation of either translation or proteasomal activity prevents homeostasis and delineated the spatial features of their association. Members of the translation apparatus such as eIF4E, active forms of p70S6 kinase and miRISC-associated MOV10 were found to remain spatially linked with subunits of the catalytically active 26S proteasome subunits such as Rpt1, Rpt3, Rpt6, α7 and E3 ligase Trim32 on polysomes. We identified that paradigms of chronic downscaling involve miRISC remodelling and entails the degradation of MOV10 via the mTOR-dependent translation of Trim32. miRISC remodelling alone is sufficient to invoke downscaling through the removal of post-synaptic AMPA receptors. Our finding proposes a multifaceted model, where synaptic scaling is regulated by compositional changes in the miRISC via protein-synthesis-driven protein degradation.

E3 ubiquitin ligases, integral components of the proteasomal degradation cascade, are critical for regulating the cellular proteome via canonical proteasome-mediated protein degradation; however, the non-canonical functions of these ligases in neuronal development are poorly understood. Our study focuses on a special class of E3 ubiquitin ligases known as RNA Binding Ubiquitin Ligases (RBUL) that harbour RNA-binding domains; allowing them to acquire all the properties of RNA-binding proteins (RBPs) and regulate transcriptional or post-transcriptional changes associated with the control of gene expression in cellular phenotypes. We aim to identify one such RUBL in the context of the highly dynamic yet stringently controlled process of neural proliferation and neural fate determination. MEX3B protein is a member of the MEX3 family and a part of the RBUL class of E3 ligases. It is differentially expressed in Neural Progenitor Cells (NPCs) upon differentiation. Mex3b RNA and protein were found to have temporally opposing expression patterns in presence of basic fibroblast growth factor (bFGF), a key signalling protein involved in neuronal proliferation. MEX3B is required for maintenance of the proliferative state of NPCs, whereas, its knockdown promotes transition from proliferative to differentiation state even in presence of bFGF that restricts differentiation. Furthermore, the knockdown of MEX3B protein results in the appearance of morphological hallmarks associated with early stages of neuronal differentiation including increase in neurite length and complexity. MEX3B interacts with the pro-proliferative transcription activator REST and the long non-coding RNA, HOTAIR. The study suggests the existence of a bFGF-dependent, combinatorial axis involving Mex3b, REST and HOTAIR, for the maintenance of NPC proliferative states. MEX3B, containing RNA binding motifs, is a unique E3 ligase that is necessary for bFGF-dependent proliferation. Mex3b protein invokes its non-canonical function of an RNA binding protein to form a tripartite complex with the transcription activator REST and HOTAIR lncRNA to define the proliferative state of NPCs. The study highlights a unique feature of special E3 ligases in neuronal proliferation during brain development that was previously overlooked.

Abstract Regulation of microtubule cytoskeleton is fundamental for the development and maintenance of neuronal architecture. Recent studies have shown that regulated RNA processing is also critical for the establishment and maintenance of neural circuits. In a genetic screen using mechanosensory neurons of C. elegans , we identified a mutation in muscleblind-1 as a suppressor of loss of kinesin-13 family microtubule destabilizing factor klp-7 . Muscleblind-1(MBL-1) is an RNA-binding protein that regulates the splicing, localization, and stability of RNA. We found that mbl-1 is required cell-autonomously for axon growth and synapse formation in the posterior lateral microtubule (PLM) neuron. Loss of mbl-1 affects stability and plus-end-out organization of microtubules in the anterior process of PLM. These defects are also accompanied by abnormal axonal transport of the synaptic protein RAB-3 and loss of gentle touch sensation in mbl-1 mutant. Our data showed that mbl-1 is genetically epistatic to mec-7 (β tubulin) and mec-12 (a tubulin) for axon growth. The immunoprecipitation of MBL-1 pulls down the mec-7, mec-12 , and sad-1 mRNAs. Additionally, the mbl-1 mutants show a reduction in the level and stability of mec-7 and mec-12 transcripts. Independently, mbl-1 is epistatic to sad-1 for synapse formation. Our work elucidated a previously unknown link between RNA binding protein and cytoskeletal machinery for the development and maintenance of the nervous system.

Summary Regulatory functions of lncRNAs in neurons have been majorly limited to the nucleus. The identity of synaptic lncRNAs and their functional role associated with synapse development and memory are poorly understood. We employed RNA-seq analysis of synaptoneurosomes to identify 94 synapse-enriched lncRNAs from the mouse hippocampus. We find Pvt1 to be a specific regulator of excitatory, but not inhibitory, synapse development in vivo . RNA-Seq from Pvt1 knockdown neurons identified down-regulated transcripts encoding pre- and post-synaptic proteins influencing synapse formation. This observation is congruent with reduction in mEPSC amplitude and frequency. We find a synapse-centric role for SynLAMP which is specifically transported to the synaptic compartment upon contextual fear conditioning (CFC) and regulate activity-dependent dendritic translation. CFC led to enhancement of interaction between SynLAMP and the translation repressor FUS, indicating SynLAMP to be a molecular decoy. SynLAMP RNAi partially occludes fear memory, suggesting an input-specific role of lncRNAs at the synapse.

Abstract Investigating the RNA regulation landscape primarily relies on our understanding of how RNA-protein interactions are governed in various cell types, including neurons. Analysis of RNA-protein interactions in physiological environments warrants the development of new tools that rely on RNA manipulation. Recently, A CRISPR-based RNA-editing tool (dCas13b-ADAR2 DD ) was developed to mitigate disease associated point mutations in cell lines. Here, we have explored the targeted sequence editing potential of the tool (dCas13b-ADAR2 DD system) by adapting it to manipulate RNA function with an aim to visualize RNA editing in primary hippocampal neurons. This is a two-component system that includes a programmable guide RNA (gRNA) complementary to the target RNA, and a catalytically dead version of the Cas13b enzyme fused to ADAR. The RNA editing protocol outlined in this manuscript relies on using the gRNA-dependent targeting of dCas13b-ADAR fusion protein to the mutant form of mDendra transcript. We first abrogated the fluorescence of Dendra2 by introducing a nonsense mutation that precludes the formation of the functional protein. To visualize the efficacy of the RNA editing in neurons, we used the dCas13b-ADAR2 DD system to edit specific nucleotides within the Dendra2 mRNA to restore the amino acid codes critical for Dendra2 fluorescence. This method therefore lays the foundation to future studies on the dynamicity of activity-induced RNA-protein interactions in neurons and can be extended to manipulate the endogenous RNome in diverse neuronal subtypes. Furthermore, this methodology will enable investigators to visualize the spatial and temporal resolution of RNA-protein interactions without altering the genomes via conventional methods. Highlights CRISPR-Cas13 based application that enables site specific A-to-I in target RNAs directed by gRNA; optimized in neurons. Enables the temporal mapping of developmentally relevant RNAs and their cis-interacting RNA binding proteins.