Summary

 The Notch protein is one of the most mechanistically direct transmembrane receptors—the intracellular domain contains a transcriptional regulator that is released from the membrane when engagement of the cognate extracellular ligand induces intramembrane proteolysis. We find that chimeric forms of Notch, in which both the extracellular sensor module and the intracellular transcriptional module are replaced with heterologous protein domains, can serve as a general platform for generating novel cell-cell contact signaling pathways. Synthetic Notch (synNotch) pathways can drive user-defined functional responses in diverse mammalian cell types. Because individual synNotch pathways do not share common signaling intermediates, the pathways are functionally orthogonal. Thus, multiple synNotch receptors can be used in the same cell to achieve combinatorial integration of environmental cues, including Boolean response programs, multi-cellular signaling cascades, and self-organized cellular patterns. SynNotch receptors provide extraordinary flexibility in engineering cells with customized sensing/response behaviors to user-specified extracellular cues. 

Video Abstract

Abstract Cells self-organize molecules in space and time to generate complex behaviors, but we lack synthetic strategies for engineering spatiotemporal signaling. We present a programmable reaction-diffusion platform for designing protein oscillations, patterns, and circuits in mammalian cells using two bacterial proteins, MinD and MinE (MinDE). MinDE circuits act like “single-cell radios”, emitting frequency-barcoded fluorescence signals that can be spectrally isolated and analyzed using digital signal processing tools. We define how to genetically program these signals and modulate their dynamics using engineerable protein-protein interactions. By connecting MinDE to endogenous cellular pathways, we built circuits that broadcast frequency-barcoded single-cell kinase activity or that synthetically pattern actin polymerization. Our work establishes a new paradigm for probing and engineering cellular activities at length and timescales critical for biological function.

Summary Cell dynamics are powered by patterns of activity, but it is not straightforward to quantify these patterns or compare them across different environmental conditions or cell-types. Here we digitize the long-term shape fluctuations of metazoan cells grown on micropatterned fibronectin islands to define and extract statistical features of cell dynamics without the need for genetic modification or fluorescence imaging. These shape fluctuations generate single-cell morphological signals that can be decomposed into two major components: a continuous, slow-timescale meandering of morphology about an average steady-state shape; and short-lived “events” of rapid morphology change that sporadically occur throughout the timecourse. By developing statistical metrics for each of these components, we used thousands of hours of single-cell data to quantitatively define how each axis of cell dynamics was impacted by environmental conditions or cell-type. We found the size and spatial complexity of the micropattern island modulated the statistics of morphological events—lifetime, frequency, and orientation—but not its baseline shape fluctuations. Extending this approach to profile a panel of triple negative breast cancer cell-lines, we found that different cell-types could be distinguished from one another along specific and unique statistical axes of their behavior. Our results suggest that micropatterned substrates provide a generalizable method to build statistical profiles of cell dynamics to classify and compare emergent cell behaviors.

Multiple active systems in a cell work together to produce sophisticated cellular behaviors such as motility and search. However, it is often unclear how this coupling specifies the complex emergent dynamics that define such behaviors. As a model system, we analyzed the hunting strategy of Lacrymaria olor, a unicellular predatory ciliate that uses extreme morphological changes to extend, contract and whip an apparent "cell neck" over many body lengths to capture prey. Tracking millions of unique subcellular morphologies over time revealed that these fast dynamics encode a comprehensive local search behavior apparent only at longer timescales. This hunting behavior emerges as a tug-of-war between active sub-cellular structures that use surface cilia and cortex contractility to deform the structure of the neck. The resulting search space can be described mathematically using a small number of normal shape modes that change amplitude rapidly during hunts. The distribution of these shape modes in space and time reveals a transition point between tense and compressed neck morphologies at the mean neck length, such that new shapes are readily sampled by repeatedly extending and retracting across this critical length. Molecular perturbations to the cell-signaling controller show that coupling between ciliary and contractile programs is needed to maintain this length/shape relationship; neither system alone provides the dynamic repertoire of shapes necessary for comprehensive search. Our results highlight the utility of coupling antagonistic active systems as a strategy for encoding or engineering complex behaviors in molecular machines.

Microtubule filaments are assembled into higher-order structures using microtubule-associated proteins. However, synthetic MAPs that direct the formation of new structures are challenging to design, as nanoscale biochemical activities must be organized across micron length-scales. Here, we develop modular MAP-IDR condensates (synMAPs) that enable inducible assembly of higher-order microtubule structures for synthetic exploration in vitro and in mammalian cells. synMAPs harness a small microtubule-binding domain from oligodendrocytes (TPPP) whose activity we show can be rewired by interaction with unrelated condensate-forming IDR sequences. This combination is sufficient to allow synMAPs to self-organize multivalent structures that bind and bridge microtubules into higher-order architectures. By regulating the connection between the microtubule-binding domain and condensate-forming components of a synMAP, the formation of these structures can be triggered by small molecules or cell-signaling inputs. We systematically test a panel of synMAP circuit designs to define how the assembly of these synthetic microtubule structures can be controlled at the nanoscale (via microtubule-binding affinity) and microscale (via condensate formation). synMAPs thus provide a modular starting point for the design of higher-order microtubule systems and an experimental testbed for exploring condensate-directed mechanisms of higher-order microtubule assembly from the bottom-up. Microtubule filaments are assembled into higher-order structures using microtubule-associated proteins. However, synthetic MAPs that direct the formation of new structures are challenging to design, as nanoscale biochemical activities must be organized across micron length-scales. Here, we develop modular MAP-IDR condensates (synMAPs) that enable inducible assembly of higher-order microtubule structures for synthetic exploration in vitro and in mammalian cells. synMAPs harness a small microtubule-binding domain from oligodendrocytes (TPPP) whose activity we show can be rewired by interaction with unrelated condensate-forming IDR sequences. This combination is sufficient to allow synMAPs to self-organize multivalent structures that bind and bridge microtubules into higher-order architectures. By regulating the connection between the microtubule-binding domain and condensate-forming components of a synMAP, the formation of these structures can be triggered by small molecules or cell-signaling inputs. We systematically test a panel of synMAP circuit designs to define how the assembly of these synthetic microtubule structures can be controlled at the nanoscale (via microtubule-binding affinity) and microscale (via condensate formation). synMAPs thus provide a modular starting point for the design of higher-order microtubule systems and an experimental testbed for exploring condensate-directed mechanisms of higher-order microtubule assembly from the bottom-up. Microtubules (MTs) are one of the major filament systems of the eukaryotic cytoskeleton, extending throughout the cell to build up internal structure, position organelles at specific locations, and facilitate vesicle transport. Individual MTs are further organized into higher-order structures and machines critical for cellular processes, such as the mitotic spindle, ciliary axonemes, and diverse protozoan cytoskeletons (1Vale R.D. The molecular motor Toolbox for Intracellular Transport.Cell. 2003; 112: 467-480Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1593) Google Scholar, 2Nogales E. Structural insights into microtubule function.Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2001; 30: 397-420Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar, 3Olmsted J.B. Microtubule-associated proteins.Annu. Rev. Cell Biol. 1986; 2: 421-457Crossref PubMed Google Scholar, 4Haimo L.T. Rosenbaum J.L. Cilia, flagella, and microtubules.J. Cell Biol. 1981; 91: 125s-130sCrossref PubMed Google Scholar). The assembly and function of these structures depends on the action of MT-associated proteins (MAPs), which bind MTs and work across cellular length scales to direct the organization of a specific target structure (5Goodson H.V. Jonasson E.M. Microtubules and microtubule-associated proteins.Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018; 10: a022608Crossref PubMed Scopus (309) Google Scholar, 6Bodakuntla S. Jijumon A.S. Villablanca C. Gonzalez-Billault C. Janke C. Microtubule-associated proteins: Structuring the cytoskeleton.Trends Cell Biol. 2019; 29: 804-819Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (170) Google Scholar). The diversity of MT-based structures and functions seen in nature suggests that synthetic MAPs could be engineered to assemble new MT structures with novel functions inside cells, analogous to how synthetic signaling proteins can rewire cellular information processing (7Roybal K.T. Lim W.A. Synthetic Immunology: Hacking Immune cells to Expand their therapeutic Capabilities.Annu. Rev. Immunol. 2017; 35: 229-253Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar, 8Morsut L. Roybal K.T. Xiong X. Gordley R.M. Coyle S.M. Thomson M. et al.Engineering Customized cell Sensing and response behaviors using synthetic Notch Receptors.Cell. 2016; 164: 780-791Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (628) Google Scholar, 9Roybal K.T. Williams J.Z. Morsut L. Rupp L.J. Kolinko I. Choe J.H. et al.Engineering T cells with Customized therapeutic response Programs using synthetic Notch Receptors.Cell. 2016; 167: 419-432.e16Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (456) Google Scholar, 10Markson J.S. Elowitz M.B. Synthetic biology of Multicellular systems: new platforms and applications for Animal cells and Organisms.ACS Synth. Biol. 2014; 3: 875-876Crossref PubMed Google Scholar). Such synthetic tools and strategies would not only be useful for cell-engineering applications but could also provide an experimental testbed exploring the general biochemical and biophysical mechanisms sufficient for directing the assembly of MT-based architectures from the bottom-up. However, because MTs are the largest filaments of the eukaryotic cytoskeleton, with a diameter of 25 nm and more than 1600 tubulin subunits per micron (11Chaaban S. Brouhard G.J. A microtubule bestiary: structural diversity in tubulin polymers.Mol. Biol. Cell. 2017; 28: 2924-2931Crossref PubMed Google Scholar, 12LaFrance B.J. Roostalu J. Henkin G. Greber B.J. Zhang R. Normanno D. et al.Structural transitions in the GTP cap visualized by cryo-electron microscopy of catalytically inactive microtubules.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2022; 119e2114994119Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar, 13Saeidi H.R. Lohrasebi A. Mahnam K. External electric field effects on the mechanical properties of the αβ-tubulin dimer of microtubules: a molecular dynamics study.J. Mol. Model. 2014; 20: 2395Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar), it is not obvious how to best engineer synthetic MAP proteins such that their nanoscale activities can be effectively integrated across the microscale within cells. Protein condensation mediated by phase separation has emerged as a mechanism by which nanoscale components can be organized and condensed into micron-scale droplets to drive biochemical interactions and chemistry in cells (14Wang B. Zhang L. Dai T. Qin Z. Lu H. Zhang L. Zhou F. Liquid–liquid phase separation in human health and diseases.Signal Transduct. Target. Ther. 2021; 6: 290Crossref PubMed Scopus (224) Google Scholar, 15Hyman A.A. Weber C.A. Jülicher F. Liquid-liquid phase separation in biology.Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2014; 30: 39-58Crossref PubMed Google Scholar, 16Li P. Banjade S. Cheng H.C. Kim S. Chen B. Guo L. et al.Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins.Nature. 2012; 483: 336-340Crossref PubMed Scopus (1675) Google Scholar, 17Brangwynne C.P. Eckmann C.R. Courson D.S. Rybarska A. Hoege C. Gharakhani J. et al.Germline P Granules are liquid droplets that localize by controlled Dissolution/condensation.Science. 2009; 324: 1729-1732Crossref PubMed Scopus (1977) Google Scholar). Although these droplets bear little resemblance to the ordered structures of the cytoskeleton, recent studies suggest roles for condensates in amplifying the activity of MAPs associated with MT bundling, branching, and tip growth such as tau, TPX2, NuMA, and +TIPs (18Hernández-Vega A. Braun M. Scharrel L. Jahnel M. Wegmann S. Hyman B.T. et al.Local nucleation of microtubule bundles through tubulin concentration into a condensed tau phase.Cell Rep. 2017; 20: 2304-2312Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 19King M.R. Petry S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation.Nat. Commun. 2020; 11: 270Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar, 20Sun M. Jia M. Ren H. Yang B. Chi W. Xin G. et al.NuMA regulates mitotic spindle assembly, structural dynamics and function via phase separation.Nat. Commun. 2021; 12: 7157Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar, 21Song X. Yang F. Yang T. Wang Y. Ding M. Li L. et al.Phase separation of EB1 guides microtubule plus-end dynamics.Nat. Cell Biol. 2023; 25: 79-91Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar, 22Woodruff J.B. Ferreira Gomes B. Widlund P.O. Mahamid J. Honigmann A. Hyman A.A. The centrosome is a selective condensate that nucleates microtubules by concentrating tubulin.Cell. 2017; 169: 1066-1077.e10Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (418) Google Scholar, 23Sahu S. Chauhan P. Lumen E. Moody K. Peddireddy K. Mani N. et al.Interplay of self-organization of microtubule asters and crosslinking protein condensates.PNAS Nexus. 2023; 2pgad231Crossref Scopus (6) Google Scholar). These observations are intriguing, as the high concentrations and reduced-order of condensates could provide the multimerization, valency, and flexibility needed to bridge length-scales (18Hernández-Vega A. Braun M. Scharrel L. Jahnel M. Wegmann S. Hyman B.T. et al.Local nucleation of microtubule bundles through tubulin concentration into a condensed tau phase.Cell Rep. 2017; 20: 2304-2312Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 19King M.R. Petry S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation.Nat. Commun. 2020; 11: 270Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar, 20Sun M. Jia M. Ren H. Yang B. Chi W. Xin G. et al.NuMA regulates mitotic spindle assembly, structural dynamics and function via phase separation.Nat. Commun. 2021; 12: 7157Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar, 21Song X. Yang F. Yang T. Wang Y. Ding M. Li L. et al.Phase separation of EB1 guides microtubule plus-end dynamics.Nat. Cell Biol. 2023; 25: 79-91Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar, 22Woodruff J.B. Ferreira Gomes B. Widlund P.O. Mahamid J. Honigmann A. Hyman A.A. The centrosome is a selective condensate that nucleates microtubules by concentrating tubulin.Cell. 2017; 169: 1066-1077.e10Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (418) Google Scholar, 23Sahu S. Chauhan P. Lumen E. Moody K. Peddireddy K. Mani N. et al.Interplay of self-organization of microtubule asters and crosslinking protein condensates.PNAS Nexus. 2023; 2pgad231Crossref Scopus (6) Google Scholar). However, these specific MAPs are not ideal candidates for synthetic manipulation and bottom-up explorations into sufficiency, as they are large multidomain proteins that work in multi-component networks to regulate structures essential for cell viability such as the mitotic spindle (24Chang C.-C. Huang T.-L. Shimamoto Y. Tsai S.-Y. Hsia K.-C. Regulation of mitotic spindle assembly factor NuMA by Importin-β.J. Cell Biol. 2017; 216: 3453-3462Crossref PubMed Scopus (25) Google Scholar, 25Chang C.-C. Hsia K.-C. More than a zip code: global modulation of cellular function by nuclear localization signals.FEBS J. 2021; 288: 5569-5585Crossref PubMed Scopus (12) Google Scholar, 26Alfaro-Aco R. Thawani A. Petry S. Structural analysis of the role of TPX2 in branching microtubule nucleation.J. Cell Biol. 2017; 216: 983-997Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar) (Fig. 1A). We sought a nonessential condensate-regulatable MAP with a simplified domain architecture that could provide a starting point for assembling and exploring synthetic MT architectures from the bottom-up. To this end, we focused on tubulin polymerization-promoting protein (TPPP). TPPP is a small 24 kDa MAP found in oligodendrocytes that contains only a single folded "CORE" domain (27Vincze O. Tökési N. Oláh J. Hlavanda E. Zotter A. Horváth I. et al.Tubulin polymerization promoting proteins (TPPPs): members of a new Family with Distinct structures and functions.Biochemistry. 2006; 45: 13818-13826Crossref PubMed Scopus (78) Google Scholar, 28DeBonis S. Neumann E. Skoufias D.A. Self protein-protein interactions are involved in TPPP/p25 mediated microtubule bundling.Sci. Rep. 2015; 513242Crossref PubMed Scopus (12) Google Scholar) (Fig. 1B). Despite its small size, TPPP is proposed to nucleate and stabilize MTs at discrete structures called Golgi outposts to promote elongation, branching, and polarization of myelin sheaths in oligodendrocytes (29Fu M. McAlear T.S. Nguyen H. Oses-Prieto J.A. Valenzuela A. Shi R.D. et al.The Golgi outpost protein TPPP nucleates microtubules and is critical for Myelination.Cell. 2019; 179: 132-146.e14Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (76) Google Scholar). Pathologically, TPPP aggregates are associated with Parkinson's disease and multiple system atrophy, and reversing TPPP aggregation has been proposed as a therapeutic strategy (30Oláh J. Ovádi J. Pharmacological targeting of α-synuclein and TPPP/p25 in Parkinson's disease: challenges and opportunities in a Nutshell.FEBS Lett. 2019; 593: 1641-1653Crossref PubMed Scopus (8) Google Scholar, 31Oláh J. Bertrand P. Ovádi J. Role of the microtubule-associated TPPP/p25 in Parkinson's and related diseases and its therapeutic potential.Expert Rev. Proteomics. 2017; 14: 301-309Crossref PubMed Scopus (15) Google Scholar, 32Ubhi K. Low P. Masliah E. Multiple system atrophy: a clinical and neuropathological perspective.Trends Neurosci. 2011; 34: 581-590Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (122) Google Scholar). Critically, the structured domain of TPPP is flanked by low-complexity intrinsically disordered sequences (IDRs), suggesting a possible role for protein condensation in its activity. Here, we take advantage of TPPP's minimal architecture and desirable features to develop synMAPs, engineered proteins that provide a regulatable platform for the assembly and synthetic exploration of higher-order MT structures in vitro and in living cells (Fig. 1A). Our designs are based on our discovery that TPPP's native MT binding and bundling activity correlate with its intrinsic ability to form protein condensates. Both in vitro and in mammalian cells, we show that MT bundling activity can be synthetically rewired by fusing TPPP fragments to orthogonal condensate-forming IDR sequences completely unrelated to MT biology. This basic control logic can be exploited to engineer circuits that regulate the connection between TPPP and IDRs, allowing the assembly of large synthetic MT architectures to be triggered by small molecules and cell-signaling inputs. By systematically testing a panel of synMAP circuits that vary the strength of the MT-binding domain or the IDR, we experimentally define how synMAP-directed MT assembly can be biochemically tuned at both the nanoscale and microscale. synMAPs thus offer a compact modular starting point engineering synthetic MT architectures in vitro and inside living cells, as well as an experimental testbed for exploring the sufficiency of condensation mechanisms to facilitate higher-order MT assembly from the bottom-up. TPPP is a small 24 kDa MAP found in oligodendrocytes that has been shown to bind and bundle MTs in vitro. Inspection of TPPP's amino acid sequence and AlphaFold structure prediction revealed a folded ''CORE'' domain flanked by unstructured N- and C-terminal regions (IDRs) (Fig. 1B). As IDRs are common features of phase separating proteins, this suggested that TPPP might represent a compact condensate-regulatable starting point for engineering synthetic MAPs. To determine the relationship between TPPP's IDRs and its biological activity, we applied three in vitro assays in parallel: 1) a droplet formation assay to determine whether a TPPP construct could phase separate in the presence of crowding reagents; 2) a TIRF-based assay for measuring binding to immobilized single MTs in the absence of crowders; and 3) a TIRF-based bundling assay that measures the fraction of MTs in bundles as a function of TPPP concentration to define an EC50 for quantitative comparison (detailed in Experimental procedures) (18Hernández-Vega A. Braun M. Scharrel L. Jahnel M. Wegmann S. Hyman B.T. et al.Local nucleation of microtubule bundles through tubulin concentration into a condensed tau phase.Cell Rep. 2017; 20: 2304-2312Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Chang C.-C. Huang T.-L. Shimamoto Y. Tsai S.-Y. Hsia K.-C. Regulation of mitotic spindle assembly factor NuMA by Importin-β.J. Cell Biol. 2017; 216: 3453-3462Crossref PubMed Scopus (25) Google Scholar, 33Hsia K.-C. Wilson-Kubalek E.M. Dottore A. Hao Q. Tsai K.L. Forth S. et al.Reconstitution of the augmin complex provides insights into its architecture and function.Nat. Cell Biol. 2014; 16: 852-863Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar). We first expressed and purified GFP-tagged full-length TPPP and the isolated TPPP-CORE domain (aa.45–166), which completely lacks the unstructured N and C termini and tested each construct for droplet formation. We found that TPPP-FL phase-separated to form droplets under a wide range of different molecular crowding conditions (Fig. 1C). In fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments, TPPP-FL droplets showed clear fluorescent recovery over time, indicating dynamic exchange behavior (Fig. S1, B and C and Video S1). In contrast, no droplets were observed for TPPP-CORE under any conditions tested. Nearly identical results were observed using untagged constructs and DIC microscopy to visualize these droplets (Figs. 1C and S1A). TPPP can thus form protein droplets in vitro that depend on the presence of its flanking IDRs. We then tested if TPPP droplet formation correlated with MT binding or bundling activity, measured in the absence of any molecular crowders. Droplet-competent TPPP-FL strongly decorated single-MTs immobilized on coverslips at concentrations as low as 600 nM, while the isolated CORE domain showed weak binding along MTs only at concentrations greater than 6 μM (Figs. 1D and S2). Similarly, while TPPP-FL showed strong MT bundling activity (EC50 = 0.54 μM), TPPP-CORE bundling was barely detectable even at concentrations greater than 6 μM (Fig. 1E). Thus, TPPP's in vitro MT binding and bundling activity correlates with its ability to form droplets. We next applied these assays to a series of TPPP truncations to quantitatively characterize the correlation between condensate formation and TPPP activity. Neither the N-terminal IDR (aa.1–44) nor the C-terminal IDR (aa.167–219) sequences were sufficient on their own to form droplets, bind, or bundle MTs (Figs. 1, F and G and S2B). However, when fused to the TPPP-CORE domain, both the N-terminal IDR (TPPP N-CORE) or the C-terminal IDR (TPPP C-CORE) could support droplet formation, MT binding, and MT bundling. Fine-scale truncations of the N-terminal IDR and C-terminal IDRs in this context showed that droplet size scaled with the length of the IDR extension (Fig. 1, G and H) and correlated with performance in our MT-bundling and single-MT binding assays (Figs. 1, F–H and S2B). Together, these data suggest that a TPPP construct's bundling activity quantitatively correlates with its propensity (size and number) to form droplets. Because the isolated TPPP-CORE domain has only weak MT-binding activity (Figs. 1E and S2B), we hypothesized that a function for condensates in this system could be to create the multimerization and high-valency needed to bridge multiple weak-binding events across multiple MTs into bundles. If true, it should be possible to engineer synthetic MAPs (synMAPs) that replace TPPP's endogenous IDRs with alternative droplet-forming sequences completely unrelated to MT biology. To test, we designed and characterized synMAP TPPP variants which fused TPPP-CORE to well-characterized phase-separating IDRs: the IDRs of DDX4 (aa.1–236), FUS (aa.1–214) and LAF-1 RGG (aa.1–200) (34Patel A. Lee H.O. Jawerth L. Maharana S. Jahnel M. Hein M.Y. et al.A liquid-to-Solid phase Transition of the ALS protein FUS Accelerated by disease Mutation.Cell. 2015; 162: 1066-1077Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1866) Google Scholar, 35McGurk L. Gomes E. Guo L. Mojsilovic-Petrovic J. Tran V. Kalb R.G. et al.Poly(ADP-Ribose) Prevents Pathological phase separation of TDP-43 by promoting liquid Demixing and stress granule localization.Mol. Cell. 2018; 71: 703-717.e9Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (272) Google Scholar, 36Elbaum-Garfinkle S. Kim Y. Szczepaniak K. Chen C.C.H. Eckmann C.R. Myong S. Brangwynne C.P. The disordered P granule protein LAF-1 drives phase separation into droplets with tunable viscosity and dynamics.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015; 112: 7189-7194Crossref PubMed Scopus (833) Google Scholar, 37Nott T.J. Petsalaki E. Farber P. Jervis D. Fussner E. Plochowietz A. et al.Phase Transition of a disordered nuage protein generates Environmentally responsive Membraneless organelles.Mol. Cell. 2015; 57: 936-947Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1214) Google Scholar, 38André A.A.M. Spruijt E. Liquid–liquid phase separation in crowded Environments.Int. J. Mol. Sci. 2020; 21: 5908Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar). These synMAP TPPP chimeras provide an orthogonal control knob for probing how arbitrary condensate formation can be harnessed to control and tune MT bundling activity (Fig. 2A). On their own, the IDRs from DDX4, FUS, and LAF-1 were unable to bind or bundle MTs (Fig. 2C). However, fusion of these IDRs to the TPPP-CORE domain to generate synMAP proteins restored MT binding, bundling, and condensate formation activities (Figs. 2, D and E and S2, C and D). We quantified the droplet intensity distributions (Fig. 2F) and bundling efficiency (Fig. 2G) of these synMAPs and compared them to native TPPP-FL and truncations. Across synMAP IDR-CORE chimeras, bundling efficiency (EC50) scaled with droplet formation activity in vitro (DDX4>FUS>LAF). The strongest of these synMAPs, DDX4-CORE, had a MT-bundling activity (EC50 = 1.47 μM) within 3-fold of WT and outperformed many native bundling-competent TPPP truncations. In contrast, synMAPs based on LAF-1 and the mutant FUSY27S (39Lin Y. Currie S.L. Rosen M.K. Intrinsically disordered sequences enable modulation of protein phase separation through distributed tyrosine motifs.J. Biol. Chem. 2017; 292: 19110-19120Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (253) Google Scholar), which only weakly form droplets, showed weak MT-bundling activity (Fig. 2, F and G). Thus, synthetic modulation of TPPP condensate formation correlates with synMAP MT bundling activity analogous to its native IDRs. While these assays show that synMAP TPPP-CORE-IDR fusions can stimulate MT bundling, they cannot resolve ultrastructural differences between the resulting bundled architectures. We thus examined the structure of native and synthetic TPPP MT bundles by negative stain electron microscopy. As has been reported previously, TPPP-FL bundles MTs into long arrays of tightly aligned MTs (26Alfaro-Aco R. Thawani A. Petry S. Structural analysis of the role of TPX2 in branching microtubule nucleation.J. Cell Biol. 2017; 216: 983-997Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar). In contrast, no bundling was observed for the condensate-deficient TPPP-CORE (Fig. 2B). synMAP IDR-CORE chimeras produced MT bundles in EM that agreed with their quantitative behavior in our in vitro bundling assays. The DDX4-CORE synMAP (EC50∼ 1.47 μM) produced bundles that closely resembled those seen for TPPP-FL, creating densely packed structures in which multiple MTs were aligned together (Fig. 2D). The weaker (EC50∼ 5.92 μM) FUS-CORE synMAP produced more disperse and less tightly-packed MT bundles (40Gouveia B. Kim Y. Shaevitz J.W. Petry S. Stone H.A. Brangwynne C.P. Capillary forces generated by biomolecular condensates.Nature. 2022; 609: 255-264Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar) (Fig. 2D). No bundled structures were seen by EM for LAF-1-CORE synMAP, although some protein clusters were detected on the surfaces of single MTs (Fig. 2D). Our results show that TPPP bundling activity can be synthetically controlled using alternative condensate-forming IDR sequences unrelated to MT biology in vitro to construct synMAP proteins. The correlation we observed between condensate formation and MT bundling across native and synthetic TPPP variants suggests that regulatable condensation could provide a mechanism for controlling synMAP MT bundling activity in cellular contexts. Our in vitro results suggest that TPPP activity in living cells might be synthetically regulated by controlling when and where it is allowed to condense. To explore this systematically, we built a blue-light triggered TPPP clustering system in 3T3 cells to reconstitute TPPP activity from the bottom-up (Fig. 3A). Our approach is based on the established "OptoDroplets" system for optically triggering condensation of Cry2-IDR fusion proteins in living cells (41Shin Y. Berry J. Pannucci N. Haataja M.P. Toettcher J.E. Brangwynne C.P. Spatiotemporal control of Intracellular phase transitions using light-Activated optoDroplets.Cell. 2017; 168: 159-171.e14Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (585) Google Scholar, 42Zhang X. Vigers M. McCarty J. Rauch J.N. Fredrickson G.H. Wilson M.Z. et al.The proline-rich domain promotes Tau liquid–liquid phase separation in cells.J. Cell Biol. 2020; 219e202006054Crossref Google Scholar). In this system, blue light triggers oligomerization of a Cry2-IDR fusion protein to increase the local concentration of its IDRs to a high enough level to drive droplet formation. We first validated this tool by expressing either mCh-Cry2WT or FUS-mCh-Cry2WT as a negative and positive control, respectively (Fig. S3A). As expected, mCh-Cry2WT showed no clusters upon light stimulation, while FUS-mCh-Cry2WT formed spherical drops distributed throughout the cell (39Lin Y. Currie S.L. Rosen M.K. Intrinsically disordered sequences enable modulation of protein phase separation through distributed tyrosine motifs.J. Biol. Chem. 2017; 292: 19110-19120Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (253) Google Scholar). Importantly, these controls showed no cross-reactivity of OptoDroplets with the MT cytoskeleton as visualized by the live-cell stain SiR-tubulin. We then applied this tool to study the behavior of different TPPP fragments upon light-induced clustering. Prior to blue-light stimulation, droplet-competent TPPP-FL showed a diffuse distribution in the cell with only faint MT decoration. However, upon 5 min of blue-light stimulation, TPPP FL formed clusters that associated with and decorated the MTs lattice of the cell (Fig. S1, B and C and Video S2). In contrast, the condensate-deficient TPPPCORE-mCh-Cry2WT remained diffuse upon blue-light stimulation and no cluster formation was observed (Fig. 3B and Video S3). Large TPPP fragments can thus be synthetically clustered to trigger association with MTs, but this does not appear to give rise to extensive bundling in a cellular context (42Zhang X. Vigers M. McCarty J. Rauch J.N. Fredrickson G.H. Wilson M.Z. et al.The proline-rich domain promotes Tau liquid–liquid phase separation in cells.J. Cell Biol. 2020; 219e202006054Crossref Google Scholar). Applying this opto-clustering method to the panel of TPPP fragments we tested in vitro, we found that C-terminal TPPP fragments showed robust cluster-induced MT association in living cells. In contrast, N-terminal TPPP fragments showed no light-dependent clustering onto MTs (Figs. 3B and S3B). Although these N-terminal fragments showed bundling and binding activity in vitro, their activity was weaker than C-terminal fragments. This suggests that the requirements for TPPP interaction with MTs in a living cell may be more stringent than in a minimal in vitro system. From this, we defined a minimal fragment (TPPP 45–196) that retains cluster-dependent MT association for synthetic applications (Fig. 3C). This experimental setup also allowed us to investigate how the lifetime of light-induced TPPP clusters was affected by different TPPP fragments. We stimulated cells with blue light for 5 min to assemble TPPP clusters and then monitored cluster disassembly over time in in the dark (Figs. 3D and S4). Consistent with previous reports, optically induced FUS-mCherry-Cry2 control droplets completely disassembled within 30 min in the dark (41Shin Y. Berry J. Pannucci N. Haataja M.P. Toettcher J.E. Brangwynne C.P. Spatiotemporal control of Intracellular phase transitions using light-Activated optoDroplets.Cell. 2017; 168: 159-171.e14Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (585) Google Scholar). In contrast, optically clustered TPPP-FL showed slow disassembly, with almost half of all TPPP clusters remaining after 1 h (Figs. 3D and S4). Applying this technique to our panel of TPPP variants, we found TPPP disassembly kinetics scaled inversely with in vitro droplet-formation activity. Collectively, these observations suggest that the condensate-forming activity of TPPP we observe in vitro can be harnessed to tune its cluster-induced association with MTs but that other mechanisms are required to reconstitute the formation of higher-order structures in living cells. Our OptoDro

Summary Microtubules filaments are assembled into higher-order structures and machines critical for cellular processes using microtubule-associated proteins (MAPs). However, the design of synthetic MAPs that direct the formation of new structures in cells is challenging, as nanoscale biochemical activities must be organized across micron length-scales. Here we develop synthetic MAP-IDR condensates (synMAPs) that provide tunable and regulatable assembly of higher-order microtubule structures in vitro and in mammalian cells. synMAPs harness a small microtubule-binding domain from oligodendrocytes (TPPP) whose activity can be synthetically rewired by interaction with condensate-forming IDR sequences. This combination allows synMAPs to self-organize multivalent structures that bind and bridge microtubules into synthetic architectures. Regulating the connection between the microtubule-binding and condensate-forming components allows synMAPs to act as nodes in more complex cytoskeletal circuits in which the formation and dynamics of the microtubule structure can be controlled by small molecules or cell-signaling inputs. By systematically testing a panel of synMAP circuit designs, we define a two-level control scheme for dynamic assembly of microtubule architectures at the nanoscale (via microtubule-binding) and microscale (via condensate formation). synMAPs provide a compact and rationally engineerable starting point for the design of more complex microtubule architectures and cellular machines.