The cytoplasm is the largest part of the cell by volume and hence its rheology sets the rate at which cellular shape changes can occur. Recent experimental evidence suggests that cytoplasmic rheology can be described by a poroelastic model, in which the cytoplasm is treated as a biphasic material consisting of a porous elastic solid meshwork (cytoskeleton, organelles, macromolecules) bathed in an interstitial fluid (cytosol). In this picture, the rate of cellular deformation is limited by the rate at which intracellular water can redistribute within the cytoplasm. However, direct supporting evidence for the model is lacking. Here we directly validate the poroelastic model to explain cellular rheology at short timescales using microindentation tests in conjunction with mechanical, chemical and genetic treatments. Our results show that water redistribution through the solid phase of the cytoplasm (cytoskeleton and macromolecular crowders) plays a fundamental role in setting cellular rheology at short timescales. It has been suggested that the cytoplasm of living cells can be described as a porous elastic meshwork bathed in an interstitial fluid. Microindentation tests now show that intracellular water redistribution plays a fundamental role in cellular rheology and that at physiologically relevant timescales cellular responses to mechanical stresses are consistent with such a poroelastic model.

The contractile actin cortex is a thin layer of actin, myosin, and actin-binding proteins that subtends the membrane of animal cells. The cortex is the main determinant of cell shape and plays a fundamental role in cell division [1Stewart M.P. Helenius J. Toyoda Y. Ramanathan S.P. Muller D.J. Hyman A.A. Hydrostatic pressure and the actomyosin cortex drive mitotic cell rounding.Nature. 2011; 469: 226-230Crossref PubMed Scopus (446) Google Scholar, 2Kunda P. Pelling A.E. Liu T. Baum B. Moesin controls cortical rigidity, cell rounding, and spindle morphogenesis during mitosis.Curr. Biol. 2008; 18: 91-101Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (319) Google Scholar, 3Bray D. White J.G. Cortical flow in animal cells.Science. 1988; 239: 883-888Crossref PubMed Scopus (418) Google Scholar], migration [4Cramer L.P. Forming the cell rear first: breaking cell symmetry to trigger directed cell migration.Nat. Cell Biol. 2010; 12: 628-632Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar], and tissue morphogenesis [5Levayer R. Lecuit T. Biomechanical regulation of contractility: spatial control and dynamics.Trends Cell Biol. 2012; 22: 61-81Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (198) Google Scholar]. For example, cortex contractility plays a crucial role in amoeboid migration of metastatic cells [6Charras G. Paluch E. Blebs lead the way: how to migrate without lamellipodia.Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008; 9: 730-736Crossref PubMed Scopus (552) Google Scholar] and during division, where its misregulation can lead to aneuploidy [7Sedzinski J. Biro M. Oswald A. Tinevez J.Y. Salbreux G. Paluch E. Polar actomyosin contractility destabilizes the position of the cytokinetic furrow.Nature. 2011; 476: 462-466Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar]. Despite its importance, our knowledge of the cortex is poor, and even the proteins nucleating it remain unknown, though a number of candidates have been proposed based on indirect evidence [8Eisenmann K.M. Harris E.S. Kitchen S.M. Holman H.A. Higgs H.N. Alberts A.S. Dia-interacting protein modulates formin-mediated actin assembly at the cell cortex.Curr. Biol. 2007; 17: 579-591Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (104) Google Scholar, 9Hannemann S. Madrid R. Stastna J. Kitzing T. Gasteier J. Schönichen A. Bouchet J. Jimenez A. Geyer M. Grosse R. et al.The Diaphanous-related Formin FHOD1 associates with ROCK1 and promotes Src-dependent plasma membrane blebbing.J. Biol. Chem. 2008; 283: 27891-27903Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 10Kitzing T.M. Wang Y. Pertz O. Copeland J.W. Grosse R. Formin-like 2 drives amoeboid invasive cell motility downstream of RhoC.Oncogene. 2010; 29: 2441-2448Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar, 11Kitzing T.M. Sahadevan A.S. Brandt D.T. Knieling H. Hannemann S. Fackler O.T. Grosshans J. Grosse R. Positive feedback between Dia1, LARG, and RhoA regulates cell morphology and invasion.Genes Dev. 2007; 21: 1478-1483Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 12Stastna J. Pan X. Wang H. Kollmannsperger A. Kutscheidt S. Lohmann V. Grosse R. Fackler O.T. Differing and isoform-specific roles for the formin DIAPH3 in plasma membrane blebbing and filopodia formation.Cell Res. 2012; 22: 728-745Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar, 13Derivery E. Fink J. Martin D. Houdusse A. Piel M. Stradal T.E. Louvard D. Gautreau A. Free Brick1 is a trimeric precursor in the assembly of a functional wave complex.PLoS One. 2008; 3: e2462Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar, 14Wyse M.M. Lei J. Nestor-Kalinoski A.L. Eisenmann K.M. Dia-interacting protein (DIP) imposes migratory plasticity in mDia2-dependent tumor cells in three-dimensional matrices.PLoS One. 2012; 7: e45085Crossref PubMed Scopus (16) Google Scholar, 15Tominaga T. Sahai E. Chardin P. McCormick F. Courtneidge S.A. Alberts A.S. Diaphanous-related formins bridge Rho GTPase and Src tyrosine kinase signaling.Mol. Cell. 2000; 5: 13-25Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (331) Google Scholar]. Here, we used two independent approaches to identify cortical actin nucleators: a proteomic analysis using cortex-rich isolated blebs, and a localization/small hairpin RNA (shRNA) screen searching for phenotypes with a weakened cortex or altered contractility. This unbiased study revealed that two proteins generated the majority of cortical actin: the formin mDia1 and the Arp2/3 complex. Each nucleator contributed a similar amount of F-actin to the cortex but had very different accumulation kinetics. Electron microscopy examination revealed that each nucleator affected cortical network architecture differently. mDia1 depletion led to failure in division, but Arp2/3 depletion did not. Interestingly, despite not affecting division on its own, Arp2/3 inhibition potentiated the effect of mDia1 depletion. Our findings indicate that the bulk of the actin cortex is nucleated by mDia1 and Arp2/3 and suggest a mechanism for rapid fine-tuning of cortex structure and mechanics by adjusting the relative contribution of each nucleator.

Abstract The immunological synapse is a molecular hub that facilitates the delivery of three activation signals, namely antigen, costimulation/corepression and cytokines, from antigen-presenting cells (APC) to T cells. T cells release a fourth class of signaling entities, trans-synaptic vesicles (tSV), to mediate bidirectional communication. Here we present bead-supported lipid bilayers (BSLB) as versatile synthetic APCs to capture, characterize and advance the understanding of tSV biogenesis. Specifically, the integration of juxtacrine signals, such as CD40 and antigen, results in the adaptive tailoring and release of tSV, which differ in size, yields and immune receptor cargo compared with steadily released extracellular vesicles (EVs). Focusing on CD40L + tSV as model effectors, we show that PD-L1 trans-presentation together with TSG101, ADAM10 and CD81 are key in determining CD40L vesicular release. Lastly, we find greater RNA-binding protein and microRNA content in tSV compared with EVs, supporting the specialized role of tSV as intercellular messengers.

ABSTRACT The T cell Immunological Synapse (IS) is a pivotal hub for the regulation of adaptive immunity by endowing the exchange of information between cells engaged in physical contacts. Beyond the integration of antigen (signal one), co-stimulation (signal two), and cytokines (signal three), the IS facilitates the delivery of T-cell effector assemblies including supramolecular attack particles (SMAPs) and extracellular vesicles (EVs). How these particulate outputs differ among T -cell subsets and how subcellular compartments and signals exchanged at the synapse contribute to their composition is not fully understood. Here we harnessed bead-supported lipid bilayers (BSLBs) as a tailorable and versatile technology for the study of synaptic particle biogenesis and composition in different T-cell subsets, including CART. These synthetic antigen-presenting cells (APCs) facilitated the characterisation of trans-synaptic vesicles (tSV) as a heterogeneous population of EVs comprising among others PM-derived synaptic ectosomes and CD63 + exosomes. We harnessed BSLB to unveil the factors influencing the vesicular release of CD40L, as a model effector, identifying CD40 trans presentation, T-cell activation, ESCRT upregulation/recruitment, antigen density/potency, co-repression by PD-1 ligands, and its processing by ADAM10 as major determinants. Further, BSLB made possible the comparison of microRNA (miR) species associated with tSV and steadily released EVs. Altogether, our data provide evidence for a higher specialisation of tSV which are enriched not only in effector immune receptors but also in miR and RNA-binding proteins. Considering the molecular uniqueness and functional complexity of the tSV output, which is also accompanied by SMAPs, we propose their classification as signal four. Graphical abstract Highlights Bead Supported Lipid Bilayers (BSLB) reconstituting antigen-presenting cells support synapse assembly by T cells and the release of effector particles. BSLB facilitate the dissection of the cellular machineries and synapse composition shaping the released tSV. tSV and their steadily released counterparts have a different composition. TSV show a higher enrichment of effectors including immune receptors, miR, RNA- and other nucleic acid-binding proteins, than EVs.

Mechanical force has repeatedly been highlighted to be involved in T cell activation. However, the biological significance of mechanical force for T cell receptor signaling remains under active consideration. Here, guided by theoretical analysis, we provide a perspective on how mechanical forces between a T cell and an antigen-presenting cell can influence the bond of a single T cell receptor major histocompatibility complex during early T cell activation. We point out that the lifetime of T cell receptor bonds and thus the degree of their phosphorylation which is essential for T cell activation depends considerably on the T cell receptor rigidity and the average magnitude and frequency of an applied oscillatory force. Such forces could be, for example, produced by protrusions like microvilli during early T cell activation or invadosomes during full T cell activation. These features are suggestive of mechanical force being exploited by T cells to advance self–nonself discrimination in early T cell activation.

Abstract Clathrin-mediated endocytosis (CME) is the main mechanism by which mammalian cells control their cell surface proteome. Proper operation of the pivotal CME cargo-adaptor AP2 requires membrane-localised FCHO. Here, live-cell eTIRF-SIM shows that FCHO marks sites of clathrin- coated pit (CCP) initiation, which mature into uniform sized CCPs comprising a central patch of AP2 and clathrin corralled by an FCHO/Eps15 ring. We dissect the network of interactions between the FCHO interdomain-linker and AP2, which concentrates, orients, tethers and partially destabilizes closed AP2 at the plasma membrane. AP2’s subsequent membrane deposition drives its opening, which triggers FCHO displacement through steric competition with PtdIns4,5P 2 , clathrin, cargo and CME accessory factors. FCHO can now relocate toward a CCP’s outer edge to engage and activate further AP2s to drive CCP growth/maturation. 125 character summary FCHO primes AP2 for CCV incorporation, a process that triggers FCHO release to enable activation/recruitment of further AP2s

SUMMARY Distal Visceral Endoderm (DVE) cells show a stereotypic unidirectional migration essential for correct orientation of the anterior-posterior axis. They migrate within a simple epithelium, the Visceral Endoderm (VE). It is unknown how DVE cells negotiate their way amongst the surrounding VE cells, what determines the bounds of DVE migration within the VE, and the relative contributions of different cell behaviours to this migration. To address these questions, we used lightsheet microscopy to generate a multi-embryo, singlecell resolution, longitudinal dataset of cell behaviour and morphology. We developed a machine learning based pipeline to segment cells and a data-informed systematic computational framework to extract and compare select morphological, behavioural and molecular parameters of all VE cells in a unified coordinate space. Unbiased clustering of this single-cell ‘phenomic’ dataset reveals considerable patterned phenotypic heterogeneity within the VE and a previously unknown sub-grouping within the DVE. While migrating, DVE cells retain regular morphology, do not exchange neighbours and are crowded, all hallmarks of the jammed state. In contrast, VE cells immediately ahead of them deform and undergo neighbour exchange. We show that DVE cells are characterised by higher levels of apical F-actin and elevated tension relative to the VE cells immediately ahead of them through which they migrate, but stop migrating upon reaching a region of the VE with matching elevated tension. Lefty1 mutants, known to show abnormal over-migration of DVE cells, show disruption to this patterned tension in the VE. Our findings provide novel insights into the control of cell behaviour during the remodelling of curved epithelia, indicating that the collective migration of sub-sets of cells can be circumscribed by modulating the mechanical properties of surrounding cells and that migrating cells in this context remain as a jammed solid flock, with surrounding cells facilitating their movement by becoming unjammed. Graphical Abstract

Semaphorin-3A (Sema3A) regulates tumor angiogenesis, but its role in modulating anti-tumor immunity is unclear. We demonstrate that Sema3A secreted within the tumor microenvironment (TME) suppresses tumor-specific CD8+ T cell function via Neuropilin-1 (NRP1), a receptor that is upregulated upon activation with T cells cognate antigen. Sema3A inhibits T cell migration, assembly of the immunological synapse, and tumor killing. It achieves these functional effects through hyper-activating the acto-myosin system in T cells leading to cellular paralysis. Finally, using a clear cell renal cell carcinoma patient cohort, we demonstrate that human tumor-specific CD8+ T cells express NRP1 and are trapped in Sema3A rich regions of tumors. Our study establishes Sema3A as a potent inhibitor of anti-tumor immunity.

Precise, analogue regulation of gene expression is critical for development, homeostasis and regeneration in mammals. In contrast, widely employed experimental and therapeutic approaches such as knock-in/out strategies are more suitable for binary control of gene activity, while RNA interference (RNAi) can lead to pervasive off-target effects and unpredictable levels of repression. Here we report on a method for the precise control of gene expression levels in mammalian cells based on engineered, synthetic microRNA response elements (MREs). To develop this system, we established a high-throughput sequencing approach for measuring the efficacy of thousands of miR-17 MRE variants. This allowed us to create a library of microRNA silencing-mediated fine-tuners (miSFITs) of varying strength that can be employed to control the expression of user specified genes. To demonstrate the value of this technology, we used a panel of miSFITs to tune the expression of a peptide antigen in a mouse melanoma model. This analysis revealed that antigen expression level is a key determinant of the anti-tumour immune response in vitro and in vivo. miSFITs are a powerful tool for modulating gene expression output levels with applications in research and cellular engineering.

Efficient generation of antibodies by B cells is one of the prerequisites of protective immunity. B cell activation by cognate antigens via B cell receptors (BCR), or pathogen-associated molecules through pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs), leads to transcriptional and metabolic changes that ultimately transform B cells into antibody producing plasma cells or memory cells. BCR signaling and a number of steps downstream of it rely on coordinated action of cellular membranes and the actin cytoskeleton, tightly controlled by concerted action of multiple regulatory proteins, some of them exclusive to B cells. Here, we dissect the role of Missing-In-Metastasis (MIM), or Metastasis suppressor 1 (MTSS1), a cancer-associated membrane and actin cytoskeleton regulating protein, in B cell-mediated immunity by taking advantage of MIM knockout mouse strain. We show undisturbed B cell development and largely normal composition of B cell compartments in the periphery. Interestingly, we found that MIM−/− B cells are defected in BCR signaling in response to surface-bound antigens but, on the other hand, show increased metabolic activity after stimulation with LPS or CpG. In vivo , MIM knockout animals exhibit impaired IgM antibody responses to immunization with T cell-independent antigen. This study provides the first comprehensive characterization of MIM in B cells, demonstrates its regulatory role for B cell-mediated immunity, as well as proposes new functions for MIM in tuning receptor signaling and cellular metabolism, processes which may also contribute to the poorly understood functions of MIM in cancer.