The blood-brain barrier (BBB) provides a constant homeostatic brain environment that is essential for proper neural function. An unusually low rate of vesicular transport (transcytosis) has been identified as one of the two unique properties of CNS endothelial cells, relative to peripheral endothelial cells, that maintain the restrictive quality of the BBB. However, it is not known how this low rate of transcytosis is achieved. Here we provide a mechanism whereby the regulation of CNS endothelial cell lipid composition specifically inhibits the caveolae-mediated transcytotic route readily used in the periphery. An unbiased lipidomic analysis reveals significant differences in endothelial cell lipid signatures from the CNS and periphery, which underlie a suppression of caveolae vesicle formation and trafficking in brain endothelial cells. Furthermore, lipids transported by Mfsd2a establish a unique lipid environment that inhibits caveolae vesicle formation in CNS endothelial cells to suppress transcytosis and ensure BBB integrity.

Blood vessels are critical to deliver oxygen and nutrients to tissues and organs throughout the body. The blood vessels that vascularize the central nervous system (CNS) possess unique properties, termed the blood-brain barrier (BBB), which allow these vessels to tightly regulate the movement of ions, molecules, and cells between the blood and the brain. This precise control of CNS homeostasis allows for proper neuronal function and protects the neural tissue from toxins and pathogens, and alterations of this barrier are important components of the pathogenesis and progression of various neurological diseases. The physiological barrier is coordinated by a series of physical, transport, and metabolic properties possessed by the brain endothelial cells (ECs) that form the walls of the blood vessels. These properties are regulated by interactions between different vascular, perivascular, immune, and neural cells. Understanding how these cell populations interact to regulate barrier properties is essential for understanding how the brain functions in both health and disease contexts.

Abstract With high energy consumption and low energy storage, the brain is highly reliant on continuous cerebral blood flow (CBF) that delivers substrates to maintain proper function, which is compromised after a stroke. The current study explores the overlapping roles played by two important modulators of cerebrovascular tone, rho-kinase (ROCK) and endogenous sex hormones, in the acute CBF responses to a photothrombotic (PT) model of ischemic stroke in ROCK2 +/- mice and wild-type (WT) littermates. To remove endogenous hormones, male mice were gonadectomized and female mice were ovariectomized, whereas control (“intact”) animals received a sham surgery prior to stroke induction. Intact WT males showed a delayed drop in CBF compared to intact WT females, where maximal CBF drop was observed 48 hours following stroke. Gonadectomy in males did not alter this response, however ovariectomy in females produced a “male-like” response. Intact ROCK2 +/- males also showed such phenotypic response, which was not altered by gonadectomy. Alternatively, intact ROCK2 +/- females showed a striking difference in CBF values compared to intact WT females, where they displayed higher CBF values immediately post-stroke and also showed a maximal CBF drop 48 hours post-stroke, which was not altered by ovariectomy. Overall, there is a marked sex difference in acute CBF responses to PT stroke, which appears to be mediated by endogenous female sex hormones and ROCK2. This study reveals important sex-differences and the involvement of ROCK2 in acute CBF responses to PT stroke in mice. Significance Statement There are very few mechanistic investigations on disparities between sexes in post-stroke CBF outcome. Rho-kinase, an important regulator of vascular tone, has only been explored in males in terms of its modulation of CBF following stroke. Both rho-kinase and endogenous female sex hormones have a converging role on the regulation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS), an important modulator of vascular tone. Rho-kinase is thought to elicit its neuroprotective effects against ischemic stroke through eNOS, however this has never been investigated in both sexes. Elucidating the cellular and molecular bases of sex differences in cerebrovascular pathophysiology is vital for understanding the origins of stroke outcomes, and for designing novel therapeutic strategies to promote functional recovery in both women and men.

Rho-associated coiled-coil containing protein kinase-2 (ROCK2) is a critical player in many cellular processes and has been incriminated in cardiovascular and neurological conditions. Recent evidence has shown that non-selective pharmacological ROCK inhibition ameliorates behavioral alterations in an autism mouse model of 16p11.2 haploinsufficiency. We had also revealed that 16p11.2-deficient mice display cerebrovascular abnormalities, including endothelial dysfunction. To investigate whether genetic blockage of ROCK2 also exerts beneficial effects on cognition and angiogenesis, we generated mice with both 16p11.2 and ROCK2 haploinsufficiency ( 16p11.2 df/+ ;Rock2 +/- ). We find that Rock2 heterozygosity on a 16p11.2 df/+ background rescues recognition memory and slightly reduces repetitive behaviors. Furthermore, brain endothelial cells (ECs) isolated from 16p11.2 df/+ ;Rock2 +/- mice display improved angiogenic capacity compared to ECs from 16p11.2 df/+ littermates. Overall, this study implicates Rock2 gene as a critical modulator in 16p11.2-associated alterations, highlighting its potential as a target for treatment of autism spectrum disorders.

Abstract Type 2 cytokines like IL-4 are hallmarks of helminth infection and activate macrophages to limit immunopathology and mediate helminth clearance. In addition to cytokines, nutrients and metabolites critically influence macrophage polarization. Choline is an essential nutrient known to support normal macrophage responses to lipopolysaccharide; however, its function in macrophages polarized by type 2 cytokines is unknown. Using murine IL-4-polarized macrophages, targeted lipidomics revealed significantly elevated levels of phosphatidylcholine, with select changes to other choline-containing lipid species. These changes were supported by the coordinated upregulation of choline transport compared to naïve macrophages. Pharmacological inhibition of choline metabolism significantly suppressed several mitochondrial transcripts and dramatically inhibited select IL-4-responsive transcripts, most notably, Retnla . We further confirmed that blocking choline metabolism diminished IL-4-induced RELMα (encoded by Retnla ) protein content and secretion and caused a dramatic reprogramming toward glycolytic metabolism. To better understand the physiological implications of these observations, naïve or mice infected with intestinal helminths Heligmosomoides polygyrus or Nippostrongylus brasiliensis were treated with the choline kinase α inhibitor, RSM-932A, to limit choline metabolism in vivo . Pharmacological inhibition of choline metabolism lowered RELMα expression across cell-types and tissues and led to the disappearance of peritoneal macrophages and B-1 lymphocytes and an influx of infiltrating monocytes. The impaired macrophage activation was associated with some loss in optimal immunity to H. polygyrus with increased egg burden, but there were no differences in intestinal worm count nor differences in N. brasiliensis parasite burden. Together, these data demonstrate that choline metabolism is required for macrophage RELMα induction, metabolic programming, and peritoneal immune homeostasis, which could have important implications in the context of other models of infection or cancer immunity. Abstract Figure

Abstract Astrocytes are intimately linked with brain vessels, a relationship that is critical for neuronal health and function. However, astroglial factors driving these physical and functional associations during postnatal brain development have yet to be identified. We characterized structural and transcriptional changes in mouse cortical astrocytes and microvessels during the first two postnatal weeks and found that high-mobility group box 1 ( Hmgb1 ), normally upregulated with injury and involved in adult cerebrovascular repair, was highly expressed in astrocytes at birth and then decreased rapidly. Astrocyte-selective ablation of Hmgb1 at birth affected astrocyte morphology and endfoot placement, altered distribution of endfoot proteins connexin43 and aquaporin-4, induced transcriptional changes in astrocytes related to cytoskeleton remodeling, and profoundly disrupted endothelial ultrastructure. While lack of astroglial Hmgb1 did not affect the blood-brain barrier or angiogenesis postnatally, it impaired neurovascular coupling and behavior in adult mice. These findings identify astroglial Hmgb1 as a key player in postnatal gliovascular maturation.