Abstract Daphnia are keystone species of freshwater habitats used as model organisms in ecology and evolution. They are also routinely used as environmental sentinels in regulatory toxicology and are increasingly contributing to new approach methodologies (NAM) for chemical risk assessments Yet, it is challenging to establish causal links between biomolecular (omics) responses to chemical exposure and their toxicity phenotypes without a baseline knowledge of tissue- and cell-morphology of healthy individuals. Here, we introduce the Da phnia H istology R eference A tlas (DaHRA, http://daphnia.io/anatomy/ ), which provides a baseline of wildtype anatomical and microanatomical structures of female and male Daphnia magna . This interactive web-based resource features overlaid vectorized demarcation of anatomical structures that compliant with an anatomical ontology created for this atlas. Since sex is environmentally induced in Daphnia , DaHRA is a map of sexual dimorphism by phenotypic plasticity. We also benchmark this tool for mechanistic toxicology by exposing Daphnia to acetaminophen and use the atlas to document its effects in organs, tissues, and cell-types. DaHRA represents an essential step towards correlating phenotypes with the discovery power of hypothesis-free, molecular backdrop against which pathology can be interpreted, thereby offering a platform to elucidate how genetic variation and external perturbations cascade through multiple biological scales to influence phenotype. Synopsis Whole-organism Daphnia atlas as foundation for unbiased phenotyping, and its utility in characterizing sexual dimorphism and effects of chemical toxicity.

Abstract Micro-CT imaging is a powerful tool for generating high resolution, isotropic three-dimensional datasets of whole, small model organisms that are useful for qualitative and quantitative analysis. D. magna , one of the most common ecological model organisms used for toxicity testing and evaluation of environmental stressors, could benefit from this imaging method for enhancing whole-organism phenotype assessment. This protocol details the steps involved in Daphnia sample preparation for micro-CT imaging: euthanasia, fixation, staining, and resin embedding. The resulting 3D reconstructions of samples imaged using synchrotron micro-CT revealed histological (microanatomic) features of organ systems, tissues, and cells in the context of the entire organism at sub-micron resolution. 3D histology and renderings enabled by this imaging method could contribute to morphometric analysis of any tissue or organ system for both descriptive and hypothesis testing studies.

Tissue phenotyping is foundational to understanding and assessing the cellular aspects of disease in organismal context and an important adjunct to molecular studies in the dissection of gene function, chemical effects, and disease. As a first step toward computational tissue phenotyping, we explore the potential of cellular phenotyping from 3-Dimensional (3D), 0.74 µm isotropic voxel resolution, whole zebrafish larval images derived from X-ray histotomography, a form of micro-CT customized for histopathology. As proof of principle towards computational tissue phenotyping of cells, we created a semi-automated mechanism for the segmentation of blood cells in the vascular spaces of zebrafish larvae, followed by modeling and extraction of quantitative geometric parameters. Manually segmented cells were used to train a random forest classifier for blood cells, enabling the use of a generalized cellular segmentation algorithm for the accurate segmentation of blood cells. These models were used to create an automated data segmentation and analysis pipeline to guide the steps in a 3D workflow including blood cell region prediction, cell boundary extraction, and statistical characterization of 3D geometric and cytological features. We were able to distinguish blood cells at two stages in development (4- and 5-days-post-fertilization) and wild-type vs. polA2 huli hutu ( hht ) mutants. The application of geometric modeling across cell types to and across organisms and sample types may comprise a valuable foundation for computational phenotyping that is more open, informative, rapid, objective, and reproducible.

Abstract Ideal 3-dimensional imaging of many complex samples, such as biological tissues made up of micro-scale structures extending over millimeter- to centimeter-scale tissue samples and organisms, requires both a wide field-of-view and high resolution. With existing optics and detectors used for micro-CT imaging, sub-micron pixel resolution can only be achieved for fields-of-view of <2 mm. This manuscript presents a unique detector system with a 6-mm field-of-view image circle and 0.5 μm pixel size that can be used in both synchrotron facilities and tabletop micro-CT units. A resolution-test pattern with linear microstructures and whole adult Daphnia magna were imaged on Beamline 8.3.2 of the Advanced Light Source. Volumes of 10,000 × 10,000 × 7,096 isotropic 0.5 μm voxels were reconstructed over a 5.0 × 3.5 mm field-of-view. Measurements in the projection domain confirmed a 1.182 μm measured spatial resolution that is largely Nyquist-limited. This unprecedented combination of field-of-view and resolution dramatically reduces the need for sectional scans and computational stitching for large samples, ultimately offering the means to elucidate change in tissue and cellular morphology in the context of larger whole, intact model organisms and specimens. This development is also anticipated to benefit micro-CT imaging in materials science, microelectronics, agricultural science, and biomedical engineering. Synopsis A custom wide-field lens and a new-generation megapixel camera enabled microCT scanning over a 3.5 × 5 mm field-of-view at a 1 μm resolution / 0.5 μm pixel size at the Berkeley Lawrence Advanced Light Source using a phantom with micron scale features. This novel combination of resolution and field-of-view will be broadly applicable to any setting in which micron-scale structures need to be characterized comprehensively in 3 dimensions over mm to cm scale.