Modern small-angle scattering (SAS) experiments with X-rays or neutrons provide a comprehensive, resolution-limited observation of the thermodynamic state. However, methods for evaluating mass and validating SAS-based models and resolution have been inadequate. Here we define the volume of correlation, Vc, a SAS invariant derived from the scattered intensities that is specific to the structural state of the particle, but independent of concentration and the requirements of a compact, folded particle. We show that Vc defines a ratio, QR, that determines the molecular mass of proteins or RNA ranging from 10 to 1,000 kilodaltons. Furthermore, we propose a statistically robust method for assessing model-data agreements (χ2free) akin to cross-validation. Our approach prevents over-fitting of the SAS data and can be used with a newly defined metric, RSAS, for quantitative evaluation of resolution. Together, these metrics (Vc, QR, χ2free and RSAS) provide analytical tools for unbiased and accurate macromolecular structural characterizations in solution. Small-angle scattering of X-rays or neutrons is more readily applied to macromolecular complexes than is X-ray crystallography, and is particularly useful for protein complexes with high flexibility; here new quantitative metrics are presented that will allow solution-derived structures to be validated and assessed for mass, resolution and accuracy. Small-angle scattering (SAS) of X-rays or neutrons is more readily applied to macromolecular complexes than is X-ray crystallography, and is particularly useful for proteins and complexes with high flexibility. John Tainer and Robert Rambo have developed a new series of quantitative metrics that allow the accuracy of such solution-derived structures to be validated. This refinement strengthens the intrinsic capabilities of SAS for high-throughput analyses and should expand its application to studying flexible macromolecules and nanoparticles in solution.

We present an efficient pipeline enabling high-throughput analysis of protein structure in solution with small angle X-ray scattering (SAXS). Our SAXS pipeline combines automated sample handling of microliter volumes, temperature and anaerobic control, rapid data collection and data analysis, and couples structural analysis with automated archiving. We subjected 50 representative proteins, mostly from Pyrococcus furiosus, to this pipeline and found that 30 were multimeric structures in solution. SAXS analysis allowed us to distinguish aggregated and unfolded proteins, define global structural parameters and oligomeric states for most samples, identify shapes and similar structures for 25 unknown structures, and determine envelopes for 41 proteins. We believe that high-throughput SAXS is an enabling technology that may change the way that structural genomics research is done.

Abstract Unstructured proteins, RNA or DNA components provide functionally important flexibility that is key to many macromolecular assemblies throughout cell biology. As objective, quantitative experimental measures of flexibility and disorder in solution are limited, small angle scattering (SAS), and in particular small angle X‐ray scattering (SAXS), provides a critical technology to assess macromolecular flexibility as well as shape and assembly. Here, we consider the Porod‐Debye law as a powerful tool for detecting biopolymer flexibility in SAS experiments. We show that the Porod‐Debye region fundamentally describes the nature of the scattering intensity decay by capturing the information needed for distinguishing between folded and flexible particles. Particularly for comparative SAS experiments, application of the law, as described here, can distinguish between discrete conformational changes and localized flexibility relevant to molecular recognition and interaction networks. This approach aids insightful analyses of fully and partly flexible macromolecules that is more robust and conclusive than traditional Kratky analyses. Furthermore, we demonstrate for prototypic SAXS data that the ability to calculate particle density by the Porod‐Debye criteria, as shown here, provides an objective quality assurance parameter that may prove of general use for SAXS modeling and validation. © 2011 Wiley Periodicals, Inc. Biopolymers 95: 559–571, 2011.

ABA Receptor Up Close Plants face a variety of environmental stresses, including drought, salinity, and cold. In the face of such stresses, the plant hormone abscisic acid (ABA) triggers adaptive physiological responses. Nishimura et al. (p. 1373 , published online 22 October; see the Perspective by Sussman and Phillips ) have now analyzed the crystal structure of one member of the ABA receptor family, PYR1 (pyrabactin resistance 1). The ABA molecule binds within an internal pocket of PYR1, where it probably induces a conformational change.

Specific tertiary structural motifs determine the complete architecture of RNA molecules (see picture for examples). Within the last few years a number of high-resolution crystal structures of complex RNAs have led to new insights into the mechanisms by which these complex folds are attained. In this review the structures of these tertiary motifs and how they influence the folding pathway of biological RNAs are discussed, as well as new developments in modeling RNA structure based upon these findings.

Structural studies show that the activity of the G-protein-coupled receptor Smoothened is modulated by ligand-regulated interactions between its extracellular and transmembrane domains. Developmental signals of the Hedgehog (Hh) and Wnt families are transduced across the membrane by Frizzled-class G-protein-coupled receptors (GPCRs) composed of both a heptahelical transmembrane domain (TMD) and an extracellular cysteine-rich domain (CRD). How the large extracellular domains of GPCRs regulate signalling by the TMD is unknown. We present crystal structures of the Hh signal transducer and oncoprotein Smoothened, a GPCR that contains two distinct ligand-binding sites: one in its TMD and one in the CRD. The CRD is stacked atop the TMD, separated by an intervening wedge-like linker domain. Structure-guided mutations show that the interface between the CRD, linker domain and TMD stabilizes the inactive state of Smoothened. Unexpectedly, we find a cholesterol molecule bound to Smoothened in the CRD binding site. Mutations predicted to prevent cholesterol binding impair the ability of Smoothened to transmit native Hh signals. Binding of a clinically used antagonist, vismodegib, to the TMD induces a conformational change that is propagated to the CRD, resulting in loss of cholesterol from the CRD–linker domain–TMD interface. Our results clarify the structural mechanism by which the activity of a GPCR is controlled by ligand-regulated interactions between its extracellular and transmembrane domains. Smoothened (SMO) is a G-protein-coupled receptor that transduces Hedgehog (Hh) signals across the membrane in all animals. Despite being a key developmental regulator, oncoprotein and drug target in oncology, the mechanism by which SMO is activated has remained unknown. These authors solve the 3.2 Å crystal structure of SMO containing its extracellular cysteine-rich (CRD), linker and heptahelical G-protein-coupled receptor (TMD) domains. Surprisingly, a cholesterol molecule was bound to SMO in the CRD binding site. Mutations predicted to prevent cholesterol binding impair the ability of SMO to transmit native Hh signals. Binding of the potent antagonist and anti-cancer drug vismodegib leads to a number of conformational changes and the loss of cholesterol from the CRD–linker domain–TMD interface.

SMARCAL1 (SWI/SNF-related, matrix-associated, actin-dependent regulator of chromatin, subfamily A-like1) maintains genome integrity during DNA replication. Here we investigated its mechanism of action. We found that SMARCAL1 travels with elongating replication forks, and its absence leads to MUS81-dependent double-strand break formation. Binding to specific nucleic acid substrates activates SMARCAL1 activity in a reaction that requires its HARP2 (Hep-A-related protein 2) domain. Homology modeling indicates that the HARP domain is similar in structure to the DNA-binding domain of the PUR proteins. Limited proteolysis, small-angle X-ray scattering, and functional assays indicate that the core enzymatic unit consists of the HARP2 and ATPase domains that fold into a stable structure. Surprisingly, SMARCAL1 is capable of binding three-way and four-way Holliday junctions and model replication forks that lack a designed ssDNA region. Furthermore, SMARCAL1 remodels these DNA substrates by promoting branch migration and fork regression. SMARCAL1 mutations that cause Schimke immunoosseous dysplasia or that inactivate the HARP2 domain abrogate these activities. These results suggest that SMARCAL1 continuously surveys replication forks for damage. If damage is present, it remodels the fork to promote repair and restart. Failures in the process lead to activation of an alternative repair mechanism that depends on MUS81-catalyzed cleavage of the damaged fork.

The SIBYLS beamline (12.3.1) of the Advanced Light Source at Lawrence Berkeley National Laboratory, supported by the US Department of Energy and the National Institutes of Health, is optimized for both small-angle X-ray scattering (SAXS) and macromolecular crystallography (MX), making it unique among the world's mostly SAXS or MX dedicated beamlines. Since SIBYLS was commissioned, assessments of the limitations and advantages of a combined SAXS and MX beamline have suggested new strategies for integration and optimal data collection methods and have led to additional hardware and software enhancements. Features described include a dual mode monochromator [containing both Si(111) crystals and Mo/B(4)C multilayer elements], rapid beamline optics conversion between SAXS and MX modes, active beam stabilization, sample-loading robotics, and mail-in and remote data collection. These features allow users to gain valuable insights from both dynamic solution scattering and high-resolution atomic diffraction experiments performed at a single synchrotron beamline. Key practical issues considered for data collection and analysis include radiation damage, structural ensembles, alternative conformers and flexibility. SIBYLS develops and applies efficient combined MX and SAXS methods that deliver high-impact results by providing robust cost-effective routes to connect structures to biology and by performing experiments that aid beamline designs for next generation light sources.

Abstract The current SARS-Covid-2 pandemic has led to an acceleration of messenger – ribonucleic acid (mRNA) vaccine technology. The development of production processes for these large mRNA molecules, especially self-amplifying mRNA (saRNA) has required concomitant development of analytical characterisation techniques. Characterising the purity, shape and structure of these biomolecules is key to their successful performance as drug products. This paper describes the biophysical characterisation of the Imperial College London Self-amplifying viral RNA vaccine (IMP-1) developed for SARS-CoV-2. A variety of analytical techniques have been used to characterise the IMP-1 RNA molecule. In this paper we use UV spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), size-exclusion chromatography small angle scattering (SEC-SAXS) and circular dichroism (CD) to determine key biophysical attributes of IMP-1. Each technique provides important information about the concentration, size, shape, structure and purity of the molecule. Statement of significance This paper is highly significant as it provides a prescient biophysical characterisation of an efficacious Sars-Cov-2 vaccine self-amplifying (sa)RNA molecule. RNA vaccines have been a major scientific breakthrough of the Covid-19 pandemic. saRNA is a further development of conventional mRNA vaccines, amplifying the RNA of interest in the cell, allowing the vaccine to be administered at lower dosages. These new biologics are distinct from previous biologics and have required distinct analytical characterisation. The analytics described herein provide detailed information on the size, shape, and structure of the RNA molecule. This paper is therefore an important step in characterising large saRNA biological relevant molecules.