Leguminous plants (such as peas and soybeans) and rhizobial soil bacteria are symbiotic partners that communicate through molecular signaling pathways, resulting in the formation of nodules on legume roots and occasionally stems that house nitrogen-fixing bacteria. Nodule formation has been assumed to be exclusively initiated by the binding of bacterial, host-specific lipochito-oligosaccharidic Nod factors, encoded by the nodABC genes, to kinase-like receptors of the plant. Here we show by complete genome sequencing of two symbiotic, photosynthetic, Bradyrhizobium strains, BTAi1 and ORS278, that canonical nodABC genes and typical lipochito-oligosaccharidic Nod factors are not required for symbiosis in some legumes. Mutational analyses indicated that these unique rhizobia use an alternative pathway to initiate symbioses, where a purine derivative may play a key role in triggering nodule formation.

ABSTRACT Rhizobia described so far belong to three distinct phylogenetic branches within the α-2 subclass of Proteobacteria . Here we report the discovery of a fourth rhizobial branch involving bacteria of the Methylobacterium genus. Rhizobia isolated from Crotalaria legumes were assigned to a new species, “ Methylobacterium nodulans ,” within the Methylobacterium genus on the basis of 16S ribosomal DNA analyses. We demonstrated that these rhizobia facultatively grow on methanol, which is a characteristic of Methylobacterium spp. but a unique feature among rhizobia. Genes encoding two key enzymes of methylotrophy and nodulation, the mxaF gene, encoding the α subunit of the methanol dehydrogenase, and the nodA gene, encoding an acyltransferase involved in Nod factor biosynthesis, were sequenced for the type strain, ORS2060. Plant tests and nodA amplification assays showed that “ M. nodulans ” is the only nodulating Methylobacterium sp. identified so far. Phylogenetic sequence analysis showed that “ M. nodulans ” NodA is closely related to Bradyrhizobium NodA, suggesting that this gene was acquired by horizontal gene transfer.

Abstract Among legumes (Fabaceae) capable of nitrogen-fixing nodulation, several Aeschynomene spp. use a unique symbiotic process that is independent of Nod factors and infection threads. They are also distinctive in developing root and stem nodules with photosynthetic bradyrhizobia. Despite the significance of these symbiotic features, their understanding remains limited. To overcome such limitations, we conducted genetic studies of nodulation in Aeschynomene evenia , supported by the development of a genome sequence for A. evenia and transcriptomic resources for 10 additional Aeschynomene spp. Comparative analysis of symbiotic genes substantiated singular mechanisms in the early and late nodulation steps. A forward genetic screen also showed that AeCRK , coding a novel receptor-like kinase, and the symbiotic signaling genes AePOLLUX, AeCCamK, AeCYCLOPS, AeNSP2 and AeNIN , are required to trigger both root and stem nodulation. This work demonstrates the utility of the A. evenia model and provides a cornerstone to unravel new mechanisms underlying the rhizobium-legume symbiosis.

Abstract Bradyrhizobium is a main rhizobial lineage of which most members nodulate legume plants using Nod factors (NFs) synthetized by the nod genes. However, members of the Photosynthetic supergroup (phylogroup) within Bradyrhizobium (PB) are nod -free but still capable of establishing nitrogen-fixing nodules with some tropical legumes of the Aeschynomene genus. These unusual findings are based on the genomic sequences of only 13 PB strains, and almost all were isolated from Aeschynomene nodules. Here, we investigate the diversity of Bradyrhizobium in grassland, forest, and rice field by rpoB amplicon sequencing and report that PB is mainly associated with rice root and rhizosphere. Moreover, we sequenced 209 new PB members isolated mostly from the rice field. The extended PB supergroup comprises three major clades: a basal clade with significant expansion of its diversity, followed by an intermediate clade composed by two strains, and a new clade exclusively represented by our new strains. Although the PB strains universally lack the canonical nod genes, all 28 assayed strains covering the broad diversity of these clades induced nodules on Aeschynomene indica . Interestingly, the three clades displayed significant differences in the efficiency of symbiosis, aligning well with their phylogenetic branching order. Our strain collection expands the ecological, phylogenetic and functional diversity of nod -free but nodulating Bradyrhizobium . With this expanded diversity, we conclude that the NF-independent nodulation of Aeschynomene is a common trait of this supergroup, in contrast to the photosynthetic trait originally thought as its unifying feature.

Some Aeschynomene legume species have the property of being nodulated by photosynthetic Bradyrhizobium lacking the nodABC genes. Knowledge of this unique Nod (factor)-independent symbiosis has been gained from the model A. evenia but our understanding remains limited due to the lack of comparative genetics with related taxa using a Nod-dependent process. To fill this gap, this study significantly broadened previous taxon sampling, including in allied genera, to construct a comprehensive phylogeny. This backbone tree was matched with data on chromosome number, genome size, low-copy nuclear genes and strengthened by nodulation tests and a comparison of the diploid species. The phylogeny delineated five main lineages that all contained diploid species while polyploid groups were clustered in a polytomy and were found to originate from a single paleo-allopolyploid event. In addition, new nodulation behaviours were revealed and Nod-dependent diploid species were shown to be tractable. The extended knowledge of the genetics and biology of the different lineages in the legume genus Aeschynomene provides a solid research framework. Notably, it enabled the identification of A. americana and A. patula as the most suitable species to undertake a comparative genetic study of the Nod-independent and Nod-dependent symbioses.