Summary Myeloid cells have a central role in homeostasis and tissue defence. Characterising the current in vitro protocols of myelopoiesis is imperative for their use in research and immunotherapy as well as for understanding the early stages of myeloid differentiation in humans. Here, we profiled the transcriptome of more than 400k cells and generated a robust molecular map of the differentiation of human induced pluripotent stem cells (iPSC) into macrophages. By integrating our in vitro datasets with in vivo single-cell developmental atlases, we found that in vitro macrophage differentiation recapitulates features of in vivo yolk sac hematopoiesis, which happens prior to the appearance of definitive hematopoietic stem cells (HSC). During in vitro myelopoiesis, a wide range of myeloid cells are generated, including erythrocytes, mast cells and monocytes, suggesting that, during early human development, the HSC-independent immune wave gives rise to multiple myeloid cell lineages. We leveraged this model to characterize the transition of hemogenic endothelium into myeloid cells, uncovering poorly described myeloid progenitors and regulatory programs. Taking advantage of the variety of myeloid cells produced, we developed a new protocol to produce type 2 conventional dendritic cells (cDC2) in vitro . We found that the underlying regulatory networks coding for myeloid identity are conserved in vivo and in vitro . Using genetic engineering techniques, we validated the effects of key transcription factors important for cDC2 and macrophage identity and ontogeny. This roadmap of early myeloid differentiation will serve as an important resource for investigating the initial stages of hematopoiesis, which are largely unexplored in humans, and will open up new therapeutic opportunities.

Abstract Lysine-specific histone demethylase 1 (LSD1), which demethylates mono- or di-methylated histone H3 on lysine 4 (H3K4me1/2), is essential for early embryogenesis and development. Here we show that LSD1 is dispensable for embryonic stem cell (ESC) self-renewal but is required for ESC growth and differentiation. Reexpression of a catalytically-dead LSD1 (LSD1 MUT ) recovers the proliferation capability of ESCs, yet the enzymatic activity of LSD1 is essential to ensure proper differentiation. Indeed, a gain of H3K4me1 in Lsd1 knockout (KO) ESCs does not lead to major changes in global gene expression programs related to stemness. However, ablation of LSD1 but not LSD1 MUT results in decreased DNMT1 and UHRF1 proteins coupled to global hypomethylation. We show that both LSD1 and LSD1 MUT control protein stability of UHRF1 and DNMT1 through interaction with the ubiquitin-specific peptidase 7 (USP7) and, consequently, inhibiting DNMT1 and UHRF1 ubiquitylation. Our studies elucidate for the first time a novel mechanism by which the scaffolding function of LSD1 controls DNA methylation in ESCs.

Summary Maintenance of pluripotency is a multifactorial process in which NF-κB is a negative regulator. Our previous work identified a chromatin role for IκBα, the master regulator of NF-κB signaling, that is critical for the proper regulation of various tissue stem cells. Here, we found that IκBα accumulates specifically in the chromatin fraction of pluripotent embryonic stem cells. IκBα depletion does not affect NF-kB-dependent transcription, but causes a profound epigenetic rewiring in pluripotent stem cells, including alterations in H3K27me3, a histone mark catalyzed by Polycomb repression complex 2. Chromatin changes induced by IκBα depletion affect a subset of pluripotency genes and are associated with altered gene transcription. At the cellular level, IκBα-deficient embryonic stem cells are arrested in a naive pluripotency state when cultured in serum/LIF conditions and fail to exit pluripotency under differentiation conditions. By constructing separation-of-function mutants, we show that the effects of IκBα in regulating stem cell pluripotency are NF-κB-independent, but mainly rely on its chromatin-related function. Taken together, our results reveal a novel mechanism by which IκBα participates in the regulation of the pluripotent state of embryonic stem cells and shed light on the interplay between inflammatory signals and the regulation of pluripotency.

Abstract Lysine-specific histone demethylase 1 (LSD1), which demethylates mono- or di- methylated histone H3 on lysine 4 (H3K4me1/2), is essential for early embryogenesis and development. Here we show that LSD1 is dispensable for mouse embryonic stem cell (ESC) self-renewal but is required for mouse ESC growth and differentiation. Reintroduction of a catalytically-impaired LSD1 (LSD1 MUT ) recovers the proliferation capability of mouse ESCs, yet the enzymatic activity of LSD1 is essential to ensure proper differentiation. Indeed, increased H3K4me1 in Lsd1 knockout (KO) mouse ESCs does not lead to major changes in global gene expression programs related to stemness. However, ablation of LSD1 but not LSD1 MUT results in decreased DNMT1 and UHRF1 proteins coupled to global hypomethylation. We show that both LSD1 and LSD1 MUT control protein stability of UHRF1 and DNMT1 through interaction with HDAC1 and the ubiquitin-specific peptidase 7 (USP7), consequently, facilitating the deacetylation and deubiquitination of DNMT1 and UHRF1. Our studies elucidate a mechanism by which LSD1 controls DNA methylation in mouse ESCs, independently of its lysine demethylase activity.

ABSTRACT Microbial challenges, such as widespread bacterial infection, induce endotoxin tolerance. This state of hyporesponsiveness to subsequent infections is mainly displayed by monocytes and macrophages. Endotoxin tolerance is generally acquired following a septic episode. In this study, we investigated DNA methylation changes during the acquisition of in vitro tolerance. We identified a set of TET2-mediated demethylation events that are specific to toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 stimulation. Lipopolysaccharide (LPS)-specific demethylation occurs at genomic sites that have low accessibility in quiescent monocytes, concomitantly with the transcriptional activation of many inflammation-related genes, and they are enriched in binding motifs for several signal transducer and activator of transcription (STAT) family members. Indeed, STAT1, STAT3 and STAT5, elements of the JAK2 pathway, are phosphorylated in association with the acquisition of endotoxin tolerance. Inhibition of the JAK2 pathway impairs the activation of tolerized genes on the first encounter with LPS. This is evidence of a crucial role for this pathway in determining the initial response of these genes to bacterial antigens and provides a pharmacological target to prevent exacerbated responses, allowing regulated responses upon subsequent challenges. Finally, we assess the pathological relevance of the JAK2 pathway in monocytes from patients with sepsis.