Blood vessels are exposed to multiple mechanical forces that are exerted on the vessel wall (radial, circumferential and longitudinal forces) or on the endothelial surface (shear stress). The stresses and strains experienced by arteries influence the initiation of atherosclerotic lesions, which develop at regions of arteries that are exposed to complex blood flow. In addition, plaque progression and eventually plaque rupture is influenced by a complex interaction between biological and mechanical factors—mechanical forces regulate the cellular and molecular composition of plaques and, conversely, the composition of plaques determines their ability to withstand mechanical load. A deeper understanding of these interactions is essential for designing new therapeutic strategies to prevent lesion development and promote plaque stabilization. Moreover, integrating clinical imaging techniques with finite element modelling techniques allows for detailed examination of local morphological and biomechanical characteristics of atherosclerotic lesions that may be of help in prediction of future events. In this ESC Position Paper on biomechanical factors in atherosclerosis, we summarize the current ‘state of the art’ on the interface between mechanical forces and atherosclerotic plaque biology and identify potential clinical applications and key questions for future research.

Background— The endoplasmic reticulum (ER) responds to various stresses by upregulation of ER chaperones, but prolonged ER stress eventually causes apoptosis. Although apoptosis is considered to be essential for the progression and rupture of atherosclerotic plaques, the influence of ER stress and apoptosis on rupture of unstable coronary plaques remains unclear. Methods and Results— Coronary artery segments were obtained at autopsy from 71 patients, and atherectomy specimens were obtained from 40 patients. Smooth muscle cells and macrophages in the fibrous caps of thin-cap atheroma and ruptured plaques, but not in the fibrous caps of thick-cap atheroma and fibrous plaques, showed a marked increase of ER chaperone expression and apoptotic cells. ER chaperones also showed higher expression in atherectomy specimens from patients with unstable angina pectoris than in specimens from those with stable angina. Expression of 7-ketocholesterol was increased in the fibrous caps of thin-cap atheroma compared with thick-cap atheroma. Treatment of cultured coronary artery smooth muscle cells or THP-1 cells with 7-ketocholesterol induced upregulation of ER chaperones and apoptosis, whereas these changes were prevented by antioxidants. We also investigated possible signaling pathways for ER-initiated apoptosis and found that the CHOP (a transcription factor induced by ER stress)-dependent pathway was activated in unstable plaques. In addition, knockdown of CHOP expression by small interfering RNA decreased ER stress-dependent death of cultured coronary artery smooth muscle cells and THP-1 cells. Conclusions— Increased ER stress occurs in unstable plaques. Our findings suggest that ER stress-induced apoptosis of smooth muscle cells and macrophages may contribute to plaque vulnerability.

Abstract Background Knowledge about lung development or lung disease is mainly derived from data extrapolated from mouse models. This comes with obvious drawbacks in developmental diseases, particularly due to species differences. Our objective is to describe the development of complementary analysis methods that will allow a better understanding of the molecular mechanisms involved in the pathogenesis of rare congenital diseases. Methods Paraffin-embedded human pediatric and fetal lung samples were laser microdissected to enrich different lung regions, namely bronchioli or alveoli. These samples were analyzed by data independent acquisition-based quantitative proteomics and lung structures were subsequently compared. To confirm the proteomic data, we employed and optimized S equential IM muno P eroxidase L abeling and E rasing (SIMPLE) staining for specific proteins of interest. Results By quantitative proteomics, we identified typical pulmonary proteins from being differentially expressed in the different regions. While the receptor for advanced glycation end products (RAGE), surfactant protein C (SFTPC) were downregulated, tubulin beta 4B (TUBB4B) was upregulated in bronchioli, compared to alveoli. In fetal tissue, CD31 was downregulated in fetal bronchioli, compared to canaliculi. Moreover, we confirmed their presence using SIMPLE staining. Some expected proteins did not show up in the proteomic data, like SOX-9 that was only detected by means of immunohistochemistry in the SIMPLE analysis. Conclusion Our data underlines the robustness and applicability of this type of experimental approach, especially for rare paraffin-embedded tissue samples. It also strengthens the importance of these methods for future studies, in particular, when considering developmental lung diseases, such as congenital lung anomalies.

Abstract During atherosclerosis, smooth muscle cells (SMCs) migrate and accumulate in the intima, where they switch from a contractile to a synthetic phenotype. This process is associated with decreased expression or loss of contractile proteins, such as α-smooth muscle actin (α-SMA) or smooth muscle myosin heavy chains (SMMHCs). We previously demonstrated that S100A4, a small calcium-binding protein, which exhibits intra- and extracellular functions, is a marker of the synthetic SMC phenotype. We have recently shown that neutralization of extracellular S100A4 in an ApoE knockout (KO) mouse model with established atherosclerotic lesions decreased the overall atherosclerotic burden. To explore the role of S100A4 in the accumulation of SMCs in the intima, we induced intimal thickening (IT) formation in full S100A4 knockout (KO) and wild type (WT) mice by completely ligating the left common carotid artery. With this model, we generated SMC-rich lesions. The deletion of S100A4 did not influence the size of the IT, neither its composition, as assessed by the expression of α-SMA and SMMHCs in S100A4 KO animals compared with WT animals, 4 weeks after ligation. Using primary cells isolated from both strains, we demonstrated that S100A4 KO SMCs were less prone to migrate than WT SMCs but they did not differ in their proliferative capacity. Our results indicate that S100A4 plays a role in SMC motility in vitro but its deletion does not influence IT formation in the mouse carotid artery ligation model.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public grant(s) – National budget only. Main funding source(s): Swiss National Science Foundation (SNSF) S100A4, a calcium-binding protein, is crucial in smooth muscle cell (SMC) phenotypic switch, yet its role in atherosclerotic plaque development and SMC plasticity remains unclear. Our previous experiments using an S100A4 neutralizing antibody approach in ApoE-/- atherosclerotic-prone mice showed reduced atherosclerotic burden but did not establish a direct link between the various S100A4-expressing cells and atherosclerosis. Herein, we show that aortic Oil RedO staining in ApoE-/-; S100A4-/- mice subjected to a 12-week high-cholesterol-diet (HCD) revealed reduced lesion areas compared to ApoE-/- mice (Figure 1, from 21.29% of the total aorta in ApoE-/-; S100A4+/+ mice to 13.27% in ApoE-/-; S100A4-/- mice), highlighting a pivotal role for S100A4 in atherosclerotic plaque development. We then used a lineage tracing ApoE-/- mouse model, in which we induced an SMC-specific deletion of S100A4 (SMC-S100A4Δ/Δ). After 12 weeks of HCD, SMC-S100A4Δ/Δ and control mice (SMC-S100A4wt/wt) were sacrificed, and aortas were processed for en face Oil Red O staining, immunohistochemistry, and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). SMC-specific deletion of S100A4 reduced the necrotic core area (from 29.75% of total plaque area in SMC-S100A4wt/wt to 18.23% in SMC-S100A4Δ/Δ mice) without affecting total atherosclerotic plaque size suggesting a more potent impact on plaque composition. ScRNA-seq analysis from SMC-S100A4Δ/Δ and SMC-S100A4wt/wt mice showed that the inflammatory macrophage-like SMC phenotype was highly suppressed in the plaque and associated with increased SMC repair phenotypes as well as a global reduction of myeloid inflammatory cells. SMCs also retained specific contractile SMC markers, namely Acta2 and Myh11 (fold change of 2.285 and 2.492, respectively) hinting towards a more stable fibrous cap. Immunofluorescence staining on aortic roots plaque (Figure 2) confirmed those results with an increase of SMCs (from 11.02% to 16.18%) as well as a-smooth muscle actin (a-SMA, Acta2)-positive SMCs (from 3.25% to 5.1%) in SMC-S100A4 Δ/Δ mice. Furthermore, the Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) of scRNAseq data revealed that, in SMC-S100A4Δ/Δ mice, genes related to mitochondrial metabolism and oxidative respiration were highly downregulated in all SMC clusters. We investigated SMC mitochondrial fitness in vitro and showed that S100A4-/- SMCs have an increased basal oxygen consumption rate and an increased proton leak (fold change of 1.37 and 1.96 respectively) suggestive of differences in cellular metabolic adaptability. In conclusion, our research emphasizes the significant role of S100A4 in plaque development, demonstrating how SMC-derived S100A4 knockdown affects plaque evolution, reducing inflammation, and promoting stability likely through influencing SMC phenotypic switch through metabolic pathways.