Summary

 The heterogeneity of endothelial cells (ECs) across tissues remains incompletely inventoried. We constructed an atlas of >32,000 single-EC transcriptomes from 11 mouse tissues and identified 78 EC subclusters, including Aqp7⁺ intestinal capillaries and angiogenic ECs in healthy tissues. ECs from brain/testis, liver/spleen, small intestine/colon, and skeletal muscle/heart pairwise expressed partially overlapping marker genes. Arterial, venous, and lymphatic ECs shared more markers in more tissues than did heterogeneous capillary ECs. ECs from different vascular beds (arteries, capillaries, veins, lymphatics) exhibited transcriptome similarity across tissues, but the tissue (rather than the vessel) type contributed to the EC heterogeneity. Metabolic transcriptome analysis revealed a similar tissue-grouping phenomenon of ECs and heterogeneous metabolic gene signatures in ECs between tissues and between vascular beds within a single tissue in a tissue-type-dependent pattern. The EC atlas taxonomy enabled identification of EC subclusters in public scRNA-seq datasets and provides a powerful discovery tool and resource value.

Summary

 Heterogeneity of lung tumor endothelial cell (TEC) phenotypes across patients, species (human/mouse), and models (in vivo/in vitro) remains poorly inventoried at the single-cell level. We single-cell RNA (scRNA)-sequenced 56,771 endothelial cells from human/mouse (peri)-tumoral lung and cultured human lung TECs, and detected 17 known and 16 previously unrecognized phenotypes, including TECs putatively regulating immune surveillance. We resolved the canonical tip TECs into a known migratory tip and a putative basement-membrane remodeling breach phenotype. Tip TEC signatures correlated with patient survival, and tip/breach TECs were most sensitive to vascular endothelial growth factor blockade. Only tip TECs were congruent across species/models and shared conserved markers. Integrated analysis of the scRNA-sequenced data with orthogonal multi-omics and meta-analysis data across different human tumors, validated by functional analysis, identified collagen modification as a candidate angiogenic pathway.

ABSTRACT Cytotoxic T cells dynamically rewire their metabolism during the course of an immune response. While T-cell metabolism has been extensively studied at phenotypic endpoints of activation and differentiation, the underlying dynamics remain largely elusive. Here, we leverage on single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) measurements of in vitro activated and differentiated CD8 + T cells cultured in physiological media to resolve these metabolic dynamics. We find that our scRNA-seq analysis identifies most metabolic changes previously defined in in vivo experiments, such as a rewiring from an oxidative to an anabolism-promoting metabolic program during activation to an effector state, which is later reverted upon memory polarization. Importantly, our scRNA-seq data further provide a dynamic description of these changes. In this sense, our data predict a differential time-dependent reliance of CD8 + T cells on the synthesis versus uptake of various non-essential amino acids during T-cell activation, which we corroborate with additional functional in vitro experiments. We further exploit our scRNA-seq data to identify metabolic genes that could potentially dictate the outcome of T-cell differentiation, by ranking them based on their expression dynamics. Among the highest-ranked hits, we find asparagine synthetase ( Asns ), whose expression sharply peaks for effector CD8 + T cells and further decays towards memory polarization. We then confirm that these in vitro Asns expression dynamics are representative of an in vivo situation in a mouse model of viral infection. Moreover, we find that disrupting these expression dynamics in vitro , by depleting asparagine from the culture media, delays central-memory polarization. Accordingly, we find that preventing the decay of ASNS by stable overexpression at the protein level in vivo leads to a significant increase in effector CD8 + T-cell expansion, and a concomitant decrease in central-memory formation, in a mouse model of viral infection. This shows that ASNS expression dynamics dictate the fate of CD8 + T-cell differentiation. In conclusion, we provide a resource of dynamic expression changes during CD8 + T-cell activation and differentiation that is expected to increase our understanding of the dynamic metabolic requirements of T cells progressing along the immune response cascade.

Abstract To capture interplay between biological pathways we analyzed the proteome from matched lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of individual allergen-naïve and house dust mite (HDM)-challenged BALB/c mice, a model of allergic asthma. Unbiased label-free LC-MS/MS analysis quantified 2,675 proteins from tissue and BALF of allergen-naïve and HDM-exposed mice. In comparing the four datasets we found significantly greater diversity in proteins between lung tissue and BALF than in the changes induced by HDM challenge. The biological pathways enriched after allergen exposure were compartment-dependent. Lung tissue featured innate immune responses and oxidative stress, while BALF most strongly revealed changes in metabolism. We combined lung tissue and BALF proteomes, which principally highlighted oxidation reduction (redox) pathways, a finding influenced chiefly by the lung tissue dataset. Integrating lung and BALF proteomes also uncovered new proteins and biological pathways that may mediate lung tissue and BALF interactions after allergen challenge, for example, B Cell Receptor signaling. We demonstrate that enhanced insight is fostered when different biological compartments from the lung are investigated in parallel. Integration of proteomes from lung tissue and BALF compartments reveals new information about protein networks in the response to environmental challenge and interaction between intracellular and extracellular process.

Abstract Introduction Aortic valve stenosis (AVS) is the most common valvular disease in the developed world. AVS involves the progressive fibro-calcific remodeling of the aortic valve (AV), which impairs function and can ultimately lead to heart failure. Due to gaps in our understanding of the underlying mechanisms of AVS, there are no pharmacological treatments nor dietary interventions known to slow AVS progression. Recent studies have begun to suggest oxylipins, a class of bioactive lipid, may be dysregulated in the valves of AVS-patients. Methodology We utilized HPLC-MS/MS to conduct a targeted oxylipin analysis on human AV tissue and plasma from a cohort of 110 patients undergoing AV surgery. Results We identified 36 oxylipins in human AV tissue with all showing significant increase in patients with severe AVS. A multivariate model including patient characteristics and valvular oxylipins identified arachidonic acid-cyclooxygenase (COX) pathway derived prostanoids to be the most associated with AVS severity. Plasma oxylipin levels were measured in a subset of aortic surgery patients and compared to a control group of healthy participants, showing distinct oxylipin profiles between control and disease. Conclusion Our comprehensive analysis of oxylipins in the human AV to date and identified the inflammatory and osteogenic regulating prostanoids to be positively correlated with AVS severity. This elucidation of prostanoid dysregulation warrants further research into COX inhibition to mitigate AVS.

ABSTRACT Serial RNA-seq studies of bulk samples are widespread and provide an opportunity for improved understanding of gene regulation during e . g ., development or response to an incremental dose of a pharmacotherapeutic. In addition, the widely popular single cell RNA-seq (scRNA-seq) data implicitly exhibit serial characteristics because measured gene expression values recapitulate cellular transitions. Unfortunately serial RNA-seq data continue to be analyzed by methods that ignore this ordinal structure and yield results that are difficult to interpret. Here, we present Error Modelled Gene Expression Analysis (EMOGEA), a principled framework for analyzing RNA-seq data that incorporates measurement uncertainty in the analysis, while introducing a special formulation for modelling data that are acquired as a function of time or other continuous variable. By incorporating uncertainties in the analysis, EMOGEA is specifically suited for RNA-seq studies in which low-count transcripts with small fold-changes lead to significant biological effects. Such transcripts include signaling mRNAs and non-coding RNAs (ncRNA) that are known to exhibit low levels of expression. Through this approach, missing values are handled by associating with them disproportionately large uncertainties which makes it particularly useful for single cell RNA-seq data. We demonstrate the utility of this framework by extracting a cascade of gene expression waves from a well-designed RNA-seq study of zebrafish embryogenesis and, a scRNA-seq study of mouse pre-implantation and provide unique biological insights into the regulation of genes in each wave. For non-ordinal measurements, we show that EMOGEA has a much higher rate of true positive calls and a vanishingly small rate for false negative discoveries compared to common approaches. Finally, we provide an R package ( https://github.com/itikadi/EMOGEA ) that is self-contained and easy to use. Graphical Abstract: Graphical representation of EMOGEA indicating the incorporation of measurement errors in modeling RNA-seq data to generate superior results in exploratory analysis, differential gene expression analyses and, scRNA-seq and Time Course analyses.