Abstract The acoustic startle response is an evolutionary conserved avoidance behavior. Disruptions in startle behavior, in particular startle magnitude, are a hallmark of several human neurological disorders. While the neural circuitry underlying startle behavior has been studied extensively, the repertoire of genes and genetic pathways that regulate this locomotor behavior has not been explored using an unbiased genetic approach. To identify such genes, we took advantage of the stereotypic startle behavior in zebrafish larvae and performed a forward genetic screen coupled with whole genome analysis. This identified mutants in eight genes critical for startle behavior, including two genes encoding proteins associated with human neurological disorders, Dolichol kinase (Dolk), a broadly expressed regulator of the glycoprotein biosynthesis pathway, and the potassium Shaker-like channel subunit Kv1.1. We demonstrate that Kv1.1 acts independently of supraspinal inputs to regulate locomotion, suggesting its site of action is within spinal circuitry. Moreover, we show that Kv1.1 protein is mis-localized in dolk mutants, suggesting they act in a common genetic pathway to regulate movement magnitude. Combined, our results identify a diverse set of eight genes all associated with human disorders that regulate zebrafish startle behavior and reveal a previously unappreciated role for Dolk and Kv1.1 in regulating movement magnitude via a common genetic pathway. Author summary Underlying all animal behaviors are neural circuits, which are controlled by numerous molecular pathways that direct neuron development and activity. To identify and study these molecular pathways that control behavior, we use a simple vertebrate behavior, the acoustic startle response, in the larval zebrafish. In response to an intense noise, larval zebrafish will quickly turn and swim away to escape. From a genetic screen, we have identified a number of mutants that behave in abnormal ways in response to an acoustic stimulus. We cloned these mutants and identified eight genes that regulate startle behavior. All eight genes are associated with human disorders, and here we focus on two genes, dolk and kcna1a , encoding Dolk, a key regulator of protein glycosylation, and the potassium channel Kv1.1, respectively. We demonstrate that loss of dolk or kcna1a causes larval zebrafish to perform exaggerated swim movements and that Dolk is required for Kv1.1 protein localization to axons of neurons throughout the nervous system, providing strong evidence that dolk and kcna1a act in a common molecular pathway. Combined, our studies provide new insights into the genetic regulation of startle behavior.

Abstract The ability to filter sensory information into relevant versus irrelevant stimuli is a fundamental, conserved property of the central nervous system and is accomplished in part through habituation learning. Synaptic plasticity that underlies habituation learning has been described at the cellular level, yet the genetic regulators of this plasticity remain poorly understood, as do circuits that mediate sensory filtering. A forward genetic screen for zebrafish genes that control habituation learning identified a mutant allele dory p177 that caused reduced habituation of the acoustic startle response. Whole-genome sequencing identified the calcium voltage-gated channel auxiliary subunit alpha-2/delta- 3 ( cacna2d3 ) as a candidate gene affected in dory p177 mutants. Behavioral characterization of larvae homozygous for two additional, independently derived mutant alleles of cacna2d3 , together with failure of these alleles to complement dory p177 , confirmed a critical role for cacna2d3 in habituation learning. Notably, detailed analyses of the acoustic response in mutant larvae also revealed increased startle sensitivity to acoustic stimuli, suggesting a broader role for cacna2d3 in controlling innate response thresholds to acoustic stimuli. Taken together, our data demonstrate a critical role for cacna2d3 in sensory filtering, a process that is disrupted in human CNS disorders, e.g. ADHD, schizophrenia, and autism.

Habituation is a foundational learning process critical for animals to adapt their behavior to changes in their sensory environment. Although habituation is considered a simple form of learning, the identification of a multitude of molecular pathways including several neurotransmitter systems that regulate this process suggests an unexpected level of complexity. How the vertebrate brain integrates these various pathways to accomplish habituation learning, whether they act independently or intersect with one another, and whether they act via divergent or overlapping neural circuits has remained unclear. To address these questions, we combined pharmacogenetic pathway analysis with unbiased whole-brain activity mapping using the larval zebrafish. This approach revealed five distinct molecular and circuit modules that regulate habituation learning and identified a set of molecularly defined brain regions associated with four of the five modules. Moreover, we find that in module 1 the palmitoyltransferase Hip14 cooperates with dopamine and NMDA signaling to drive plasticity, while in module 3 the adaptor protein complex subunit Ap2s1 drives habituation by antagonizing dopamine signaling, revealing two distinct and opposing roles for dopaminergic neuromodulation in the regulation of learning. Combined, our results define a core set of distinct modules that act in concert to regulate learning-associated plasticity, and provide compelling evidence that even seemingly simple learning behaviors in a compact vertebrate brain are regulated by a complex and overlapping set of molecular and circuit mechanisms.

Behavioral thresholds define the lowest stimulus intensities sufficient to elicit a behavioral response. Establishment of baseline behavioral thresholds during development is critical for proper responses throughout the animal's life. Despite the relevance of such innate thresholds, the molecular mechanisms critical to establishing behavioral thresholds during development are not well understood. The acoustic startle response is a conserved behavior whose threshold is established during development yet is subsequently acutely regulated. We have previously identified a zebrafish mutant line ( escapist ) that displays a decreased baseline or innate acoustic startle threshold. Here, we identify a single base pair substitution on Chromosome 25 located within the coding sequence of the synaptotagmin 7a ( syt7a ) gene that is tightly linked to the escapist acoustic hypersensitivity phenotype. By generating animals in which we deleted the syt7a open reading frame, and subsequent complementation testing with the escapist line, we demonstrate that loss of syt7a function is not the cause of the escapist behavioral phenotype. Nonetheless, escapist mutants provide a powerful tool to decipher the overlap between acute and developmental regulation of behavioral thresholds. Extensive behavioral analyses reveal that in escapist mutants the establishment of the innate acoustic startle threshold is impaired, while regulation of its acute threshold remains intact. Moreover, our behavioral analyses reveal a deficit in baseline responses to visual stimuli, but not in the acute regulation of responses to visual stimuli. Together, this work eliminates loss of syt7a as causative for the escapist phenotype and suggests that mechanisms that regulate the establishment of behavioral thresholds in escapist larvae can operate largely independently from those regulating acute threshold regulation.

Active zone proteins cluster synaptic vesicles at presynaptic terminals and coordinate their release. In forward genetic screens we isolated a novel C. elegans active zone gene, clarinet (cla-1). cla-1 mutants exhibit defects in synaptic vesicle clustering, reduced spontaneous neurotransmitter release, increased synaptic depression and reduced synapse number. Ultrastructurally, cla-1 mutants have fewer synaptic vesicles adjacent to the dense projection and an increased number of docked vesicles. Cla-1 encodes 3 isoforms containing common C-terminal PDZ and C2 domains with homology to vertebrate active zone proteins Piccolo and RIM. The short isoform localizes exclusively to the active zone while a longer ~9000 amino acid isoform colocalizes with synaptic vesicles. Specific loss of CLA-1L results in synaptic vesicle clustering defects and increased synaptic depression, but not in reduced synapse number or mini frequency. Together our data indicate that specific isoforms of clarinet serve distinct functions, regulating synapse development, synaptic vesicle clustering and release.

Habituation is an adaptive learning process that enables animals to adjust innate behaviors to changes in the environment. Despite its well documented implications for a wide diversity of behaviors, the molecular and cellular basis of habituation learning is not well understood. Using whole genome sequencing of zebrafish mutants isolated in an unbiased genetic screen, we identified the palmitoyltransferase Hip14 as a critical regulator of habituation learning. We demonstrate that Hip14 regulates depression of sensory inputs onto an identified neuron and provide compelling evidence that Hip14 palmitoylates the Shaker-like channel subunit Kv1.1, thereby regulating Kv1.1 subcellular localization. Furthermore, we show that loss of either Kv1.1 or Hip14 leads to habituation deficits, and that Hip14 is dispensable in development and instead acts acutely to promote habituation. Combined, our results uncover a previously unappreciated role for acute post-translational palmitoylation at defined circuit components to regulate learning.

Changes in neuronal activity create local and transient changes in energy demands at synapses. Here we discover a metabolic compartment that forms in vivo near synapses to meet local energy demands and support synaptic function in Caenorhabditis elegans neurons. Under conditions of energy stress, glycolytic enzymes redistribute from a diffuse localization in the cytoplasm to a punctate localization adjacent to synapses. Glycolytic enzymes colocalize, suggesting the ad hoc formation of a glycolysis compartment, or a 'glycolytic metabolon', that can maintain local levels of ATP. Local formation of the glycolytic metabolon is dependent on presynaptic scaffolding proteins, and disruption of the glycolytic metabolon blocks the synaptic vesicle cycle, impairs synaptic recovery, and affects locomotion. Our studies indicate that energy demands in neurons are met locally through the assembly of a glycolytic metabolon to sustain synaptic function and behavior.