Despite over a century of observations, the obligate insect parasites within the order Entomophthorales remain poorly characterized at the genetic level. This is in part due to their large genome sizes and difficulty in obtaining sequenceable material. In this manuscript, we leveraged a recently-isolated, laboratory-tractable Entomophthora muscae isolate and improved long-read sequencing to obtain a largely-complete entomophthoralean genome. Our E. muscae assembly is 1.03 Gb, consists of 7,810 contigs and contains 81.3% complete fungal BUSCOs. Using a comparative approach with other available (transcriptomic and genomic) datasets from entomophthoralean fungi, we provide new insight into the biology of these understudied pathogens. We offer a head-to-head comparison of morphological and molecular data for species within the E. muscae species complex. Our findings suggest that substantial taxonomic revision is needed to define species within this group and we provide recommendations for differentiating strains and species in the context of the existing body of E. muscae scientific literature. We show that giant genomes are the norm within Entomophthoraceae owing to extensive, but not recent, Ty3 retrotransposon activity, despite the presence of anti-transposable element defense machinery (RNAi). In addition, we find that E. muscae and its closest allies are enriched for M16A peptidases and possess genes that are likely homologs to the blue-light sensor white-collar 1, a Neurospora crassa gene that has a well-established role in maintaining circadian rhythms. We find that E. muscae has an expanded group of acid-trehalases, consistent with trehalose being the primary sugar component of fly (and insect) hemolymph. We uncover evidence that E. muscae diverged from other entomophthoralean fungi by expansion of existing families, rather than loss of particular domains, and possesses a potentially unique suite of secreted catabolic enzymes, consistent with E. muscae's species-specific, biotrophic lifestyle. Altogether, we provide a genetic and molecular foundation that we hope will provide a platform for the continued study of the unique biology of entomophthoralean fungi.

Fungivorous millipedes (subterclass Colobognatha) likely represent some of the earliest known mycophagous terrestrial arthropods, yet their fungal partners remain elusive. Here we describe relationships between fungi and the fungivorous millipede, Brachycybe lecontii. Their fungal community is surprisingly diverse with 176 genera, 39 orders, and four phyla and includes several undescribed species. Of particular interest are twelve genera conserved across wood substrates and millipede clades that comprise the core fungal community of B. lecontii. Wood decay fungi, long speculated to serve as the primary food source for Brachycybe species, were absent from this core assemblage and proved lethal to millipedes in pathogenicity assays while entomopathogenic Hypocreales were more common in the core but had little effect on millipede health. This study represents the first survey of fungal communities associated with any colobognath millipede, and these results offer a glimpse into the complexity of millipede fungal communities.

The fungal genus Massospora (Zoopagomycota: Entomophthorales) includes more than a dozen obligate, sexually transmissible pathogenic species that infect cicadas (Hemiptera) worldwide. At least two species are known to produce psychoactive compounds during infection, which has garnered considerable interest for this enigmatic genus. As with many Entomophthorales, the evolutionary relationships and host associations of Massospora spp. are not well understood. The acquisition of M. diceroproctae from Arizona, M. tettigatis from Chile, and M. platypediae from California and Colorado provided an opportunity to conduct molecular phylogenetic analyses and morphological studies to investigate if these fungi represent a monophyletic group and delimit species boundaries. In a three-locus phylogenetic analysis including the D1–D2 domains of the nuclear 28S rRNA gene (28S), elongation factor 1 alpha-like (EFL), and beta-tubulin (BTUB), Massospora was resolved in a strongly supported monophyletic group containing four well-supported genealogically exclusive lineages, based on two of three methods of phylogenetic inference. There was incongruence among the single-gene trees: two methods of phylogenetic inference recovered trees with either the same topology as the 3-gene concatenated tree (EFL), or a basal polytomy (28S, BTUB). Massospora levispora and M. platypediae isolates formed a single lineage in all analyses and are synonymized here as M. levispora . Massospora diceroproctae was sister to M. cicadina in all three single-gene trees and on an extremely long branch relative to the other Massospora , and even the outgroup taxa, which may reflect an accelerated rate of molecular evolution and/or incomplete taxa sampling. The results of the morphological study presented here indicate that spore measurements may not be phylogenetically or diagnostically informative. Despite recent advances in understanding the ecology of Massospora , much about its host range and diversity remains unexplored. The emerging phylogenetic framework can provide a foundation for exploring co-evolutionary relationships with cicada hosts and the evolution of behavior-altering compounds.

Entomopathogenic fungi routinely kill their hosts before releasing infectious spores, but select species keep insects alive while sporulating, which enhances dispersal. Transcriptomics and metabolomics studies of entomopathogens with post-mortem dissemination from their parasitized hosts have unraveled infection processes and host responses, yet mechanisms underlying active spore transmission by Entomophthoralean fungi in living insects remain elusive. Here we report the discovery, through metabolomics, of the plant-associated amphetamine, cathinone, in four Massospora cicadina-infected periodical cicada populations, and the mushroom-associated tryptamine, psilocybin, in annual cicadas infected with Massospora platypediae or Massospora levispora, which appear to represent a single fungal species. The absence of some fungal enzymes necessary for cathinone and psilocybin biosynthesis along with the inability to detect intermediate metabolites or gene orthologs are consistent with possibly novel biosynthesis pathways in Massospora. The neurogenic activities of these compounds suggest the extended phenotype of Massospora that modifies cicada behavior to maximize dissemination is chemically-induced.

Millipedes have long been known to produce a diverse array of chemical defense agents that deter predation. These compounds, or their precursors, are stored in high concentration within glands (ozadenes) and are released upon disturbance. The subterclass Colobognatha contains four orders of millipedes, all of which are known to produce terpenoid alkaloids-spare the Siphonophorida that produce terpenes. Although these compounds represent some of the most structurally-intriguing millipede-derived natural products, they are the least studied class of millipede defensive secretions. Here, we describe the chemistry of millipede defensive secretions from three species of Brachycybe: Brachycybe producta, Brachycybe petasata, and Brachycybe rosea. Chemical investigations using mass spectrometry-based metabolomics, chemical synthesis, and 2D NMR led to the identification of five alkaloids, three of which are new to the literature. All identified compounds are monoterpene alkaloids with the new compounds representing indolizidine (i.e. hydrogosodesmine) and quinolizidine alkaloids (i.e. homogosodesmine and homo-hydrogosodesmine). The chemical diversity of these compounds tracks the known species phylogeny of this genus, rather than the geographical proximity of the species. The indolizidines and quinolizidines are produced by non-sympatric sister species, B. producta and B. petasata, while deoxybuzonamine is produced by another set of non-sympatric sister species, B. rosea and Brachycybe lecontii. The fidelity between the chemical diversity and phylogeny strongly suggests that millipedes generate these complex defensive agents de novo and begins to provide insights into the evolution of their biochemical pathways.

Abstract The entomopathogenic fungus Conoideocrella luteorostrata (Hypocreales: Clavicipitaceae) has recently been implicated in natural epizootics among exotic elongate hemlock scale (EHS) insects in Fraser fir Christmas tree farms in the eastern U.S. Since 1913, asexual populations of C. luteorostrata have been reported from various plant-feeding Hemiptera in the southeastern U.S., but a thorough morphological and phylogenetic examination of the species, particularly detailed characterization of populations involved in recent epizootics in EHS, are lacking. The recovery of multiple strains of C. luteorostrata from mycosed EHS cadavers collected in Ashe County North Carolina provided an opportunity to conduct pathogenicity assays and morphological and phylogenetic studies to investigate genus- and species-level boundaries among members of the Clavicipitaceae. Pathogenicity assays confirmed C. luteorostrata causes mortality of EHS first instar crawlers, an essential first step in developing C. luteorostrata as a biocontrol. The results of the morphological study failed to recover a sexual stage from EHS cadavers or pure cultures, but revealed conidia aligned with previous measurements of the paecilomyces-like asexual state of C. luteorostrata (6.9 µm x 2.6 µm average), with colony and conidiophore morphology consistent with previously reported observations. Additionally, a hirsutella-like synanamorph of C. luteorostrata was observed for the first time under specific lab conditions. In both a four-locus, 54-taxa Clavicipitaceae-wide phylogenetic analysis including the D1–D2 domains of the nuclear 28S rRNA gene (28S), elongation factor 1 alpha (EF1-α), DNA-directed RNA polymerase II subunit 1 (RPB1) and DNA-directed RNA polymerase II subunit 2 (RPB2) and a two-locus, 38-taxa (28S & EF1-α) phylogenetic analysis, C. luteorostrata , C. tenuis and C. krungchingensis were resolved as strongly supported monophyletic lineages across all loci and both methods (maximum likelihood & Bayesian inference) of phylogenetic inference with the exception of 28S for C. tenuis . Despite the strong support for individual Conoideocrella species, none of the analyses supported the monophyly of the genus, with the inclusion of Dussiella . Due to the paucity of publicly available RPB1 and RPB2 sequence data for Conoideocrella , EF1-α provided superior delimitation of intraspecies groupings for C. luteorostrata and C. tenuis and should be used in future studies. Further development of C. luteorostrata as a biocontrol agent against EHS both in Christmas tree farms and surrounding hemlock forests will require additional surveys across diverse Hemiptera and expanded pathogenicity testing to better understand host range and efficacy of this fungus.