Tay-Sachs and Sandhoff diseases (GM2 gangliosidosis) are autosomal recessive disorders of lysosomal function that cause fatal and progressive neurodegeneration in infants and young children. Impaired hydrolysis catalysed by β-hexosaminidase A (HexA) leads to the accumulation of its specific substrate, GM2 ganglioside, in neuronal lysosomes. Despite the development of a florid storage phenotype, the role of autophagy and its regulation by the mammalian target of rapamycin (mTOR) has yet to be explored in the neuropathogenesis. Accordingly, we investigated the effects on autophagy and lysosomal integrity using skin fibroblasts obtained from patients with Tay-Sachs and Sandhoff diseases. Pathological autophagosomes, with enhanced expression of the p62/SQSTM1 protein, suggested impaired autophagic flux, an abnormality confirmed by electron microscopy and biochemical studies revealing the accelerated release of mature cathepsins and HexA into the cytosol, indicating increased lysosomal permeability. GM2 fibroblasts showed inappropriately diminished mTOR signalling with reduced basal mTOR activity. Accordingly, provision of a positive nutrient signal by L-arginine supplementation partially restored mTOR activity and ameliorated the cytopathological abnormalities - and immediately suggests an avenue for therapeutic exploration in this cruel disease. We also contend that the expression of autophagy/lysosome/mTOR-associated molecules may prove useful peripheral biomarkers for facile monitoring of systemic treatment of GM2 gangliosidosis and neurodegenerative disorders that affect the lysosomal function and disrupt autophagy

CRISPR-Cas systems are acquired immunity systems of bacteria and archaea that prevent infection by phages and other mobile genetic elements. It is currently known that this defense system has also been co-opted by viruses. These viruses could use CRISPR-Cas systems to compete against other rival viruses. We have discovered a virus in the bacterium Acinetobacter baumannii that incorporates a CRISPR-Cas system into an integration hotspot of the host genome. Once integrated, this CRISPR-Cas system could prevent the infection of the most frequent viruses in this bacterial species, especially one that competes with the CRISPR-Cas system itself for the same integration site. This latter virus is prevalent in strains of the species belonging to the so-called Global Clone 2, which causes the most frequent outbreaks worldwide. According to the World Health Organisation, A. baumannii is a top-priority opportunistic pathogen with an increasing number of isolates emerging as multi-drug resistant. The knowledge about this new viral warfare using CRISPR-Cas systems, which are known to limit the entry of antibiotic resistance genes into bacteria, could be useful in the fight against the infections they cause.

Abstract Antimicrobial resistance is widely recognized as a serious global public health problem. To combat this threat, a thorough understanding of bacterial genomes is necessary. The current wide availability of bacterial genomes provides us with an in-depth understanding of the great variability of dispensable genes and their relationship with antimicrobials. Some of these accessory genes are those involved in CRISPR-Cas systems, which are acquired immunity systems that are present in part of bacterial genomes. They prevent viral infections through small DNA fragments called spacers. But the vast majority of these spacers have not yet been associated with the virus they recognize, and this has been named CRISPR dark matter. By analyzing the spacers of tens of thousands of genomes from six bacterial species highly resistant to antibiotics, we have been able to reduce the CRISPR dark matter from 80-90% to as low as 15% in some of the species. In addition, we have observed that, when a genome presents CRISPR-Cas systems, this is accompanied by particular collections of membrane proteins. Our results suggest that when a bacterium presents membrane proteins that make it compete better in its environment, and these proteins are in turn receptors for specific phages, it would be forced to acquire CRISPR-Cas immunity systems to avoid infection by these phages.

ABSTRACT The requirement for Cas nucleases to recognize a specific PAM is a major restriction for genome editing. SpCas9 variants SpG and SpRY, recognizing NGN and NRN PAM, respectively, have contributed to increase the number of editable genomic sites in cell cultures and plants. However, their use has not been demonstrated in animals. We have characterized and optimized the activity of SpG and SpRY in zebrafish and C. elegans . Delivered as mRNA-gRNA or ribonucleoprotein (RNP) complexes, SpG and SpRY were able to induce mutations in vivo , albeit at a lower rate than SpCas9 in equivalent formulations. This lower activity was overcome by optimizing mRNA-gRNA or RNP concentration, leading to efficient mutagenesis at regions inaccessible to SpCas9. We also found that the CRISPRscan algorithm can predict SpG and SpRY activity in vivo . Finally, we applied SpG and SpRY to generate knock-ins by homology-directed repair. Altogether, our results expand the CRISPR-Cas targeting genomic landscape in animals.