Genetic screens help infer gene function in mammalian cells, but it has remained difficult to assay complex phenotypes-such as transcriptional profiles-at scale. Here, we develop Perturb-seq, combining single-cell RNA sequencing (RNA-seq) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-based perturbations to perform many such assays in a pool. We demonstrate Perturb-seq by analyzing 200,000 cells in immune cells and cell lines, focusing on transcription factors regulating the response of dendritic cells to lipopolysaccharide (LPS). Perturb-seq accurately identifies individual gene targets, gene signatures, and cell states affected by individual perturbations and their genetic interactions. We posit new functions for regulators of differentiation, the anti-viral response, and mitochondrial function during immune activation. By decomposing many high content measurements into the effects of perturbations, their interactions, and diverse cell metadata, Perturb-seq dramatically increases the scope of pooled genomic assays.

Various cis-regulatory functions of genomic loci that produce long non-coding RNAs are revealed, including instances where their promoters have enhancer-like activity and the lncRNA transcripts themselves are not required for activity. Since the discovery of pervasive transcription of long non-coding RNAs (lncRNAs) in mammalian genomes, there has been pressure to determine their functions. Here, Eric Lander and colleagues use a CRISPR/Cas9 deletion approach to uncover various cis-regulatory functions of lncRNAs, including instances in which their promoters have enhancer-like activity and the lncRNA transcripts themselves are often not required for activity. Such effects on neighbouring genes are also seen for protein-coding loci. Mammalian genomes are pervasively transcribed1,2 to produce thousands of long non-coding RNAs (lncRNAs)3,4. A few of these lncRNAs have been shown to recruit regulatory complexes through RNA–protein interactions to influence the expression of nearby genes5,6,7, and it has been suggested that many other lncRNAs can also act as local regulators8,9. Such local functions could explain the observation that lncRNA expression is often correlated with the expression of nearby genes2,10,11. However, these correlations have been challenging to dissect12 and could alternatively result from processes that are not mediated by the lncRNA transcripts themselves. For example, some gene promoters have been proposed to have dual functions as enhancers13,14,15,16, and the process of transcription itself may contribute to gene regulation by recruiting activating factors or remodelling nucleosomes10,17,18. Here we use genetic manipulation in mouse cell lines to dissect 12 genomic loci that produce lncRNAs and find that 5 of these loci influence the expression of a neighbouring gene in cis. Notably, none of these effects requires the specific lncRNA transcripts themselves and instead involves general processes associated with their production, including enhancer-like activity of gene promoters, the process of transcription, and the splicing of the transcript. Furthermore, such effects are not limited to lncRNA loci: we find that four out of six protein-coding loci also influence the expression of a neighbour. These results demonstrate that cross-talk among neighbouring genes is a prevalent phenomenon that can involve multiple mechanisms and cis-regulatory signals, including a role for RNA splice sites. These mechanisms may explain the function and evolution of some genomic loci that produce lncRNAs and broadly contribute to the regulation of both coding and non-coding genes.

Abstract The evolution of innate behaviors is ultimately due to genetic variation likely acting in the nervous system. Gene regulation may be particularly important because it can evolve in a modular brain-region specific fashion through the concerted action of cis - and trans -regulatory changes. Here, to investigate transcriptional variation and its regulatory basis across the brain, we perform RNA sequencing (RNA-Seq) on ten brain subregions in two sister species of deer mice ( Peromyscus maniculatus and P. polionotus ) – which differ in a range of innate behaviors, including their social system – and their F 1 hybrids. We find that most of the variation in gene expression distinguishes subregions, followed by species. Interspecific differential expression (DE) is pervasive (52–59% of expressed genes), whereas the number of DE genes between sexes is modest overall (∼3%). Interestingly, the identity of DE genes varies considerably across brain regions. Much of this modularity is due to cis -regulatory divergence, and while 43% of genes were consistently assigned to the same gene regulatory class across subregions (e.g., conserved, cis -, or trans -regulatory divergence), a similar number were assigned to two or more different gene regulatory classes. Together, these results highlight the modularity of gene expression differences and divergence in the brain, which may be key to explain how the evolution of brain gene expression can contribute to the astonishing diversity of animal behaviors.

BACKGROUND: Recent advances in transcriptome sequencing have enabled the discovery of thousands of long non-coding RNAs (lncRNAs) across multitudes of species. Though several lncRNAs have been shown to play important roles in diverse biological processes, the functions and mechanisms of most lncRNAs remain unknown. Two significant obstacles lie between transcriptome sequencing and functional characterization of lncRNAs: 1) identifying truly noncoding genes from de novo reconstructed transcriptomes, and 2) prioritizing hundreds of resulting putative lncRNAs from each sample for downstream experimental interrogation. RESULTS: We present slncky, a computational lncRNA discovery tool that produces a high-quality set of lncRNAs from RNA-Sequencing data and further prioritizes lncRNAs by characterizing selective constraint as a proxy for function. Our filtering pipeline is comparable to manual curation efforts and more sensitive than previously published approaches. Further, we develop, for the first time, a sensitive alignment pipeline for aligning lncRNA loci and propose new evolutionary metrics relevant for both sequence and transcript evolution. Our analysis reveals that selection acts in several distinct patterns, and uncovers two notable classes of lncRNAs: one showing strong purifying selection at RNA sequence and another where constraint is restricted to the regulation but not the sequence of the transcript. CONCLUSION: Our novel comparative methods for lncRNAs reveals 233 constrained lncRNAs out of tens of thousands of currently annotated transcripts, which we believe should be prioritized for further interrogation. To aid in their analysis we provide the slncky Evolution Browser as a resource for experimentalists.

Genetic variation is known to contribute to the variation of animal social behavior, but the molecular mechanisms that lead to behavioral differences are still not fully understood. Here, we investigate the cellular evolution of the hypothalamic medial preoptic area (MPOA), a brain region that plays a critical role in social behavior, across two sister species of deer mice (Peromyscus maniculatus and P. polionotus) with divergent social systems. These two species exhibit large differences in mating and parental care behavior across species and sex. Using single-nucleus RNA-sequencing, we build a cellular atlas of the MPOA for males and females of both Peromyscus species. We identify four cell types that are differentially abundant across species, two of which may account for species differences in parental care behavior. Our data further implicate two sex-biased cell types to be important for the evolution of sex-specific behavior. Finally, we show a remarkable reduction of sex-biased gene expression in P. polionotus, a monogamous species that also exhibits reduced sexual dimorphism in parental care behavior. Our MPOA atlas is a powerful resource to investigate how molecular neuronal traits may be evolving to give rise to innate differences in social behavior across animal species.