ABSTRACT Three dimensional (3D) collective cell migration (CCM) is critical for improving liver cell therapies, eliciting mechanisms of liver disease, and modeling human liver development/ organogenesis. Here, we modeled liver organogenesis to induce 3D CCM and improve existing models. The liver diverticulum, normally surrounded by septum transversum mesenchyme (STM) at E8.5, was modeled with a miniature liver spheroid surrounded by mesenchymal cells and matrix. In mixed spheroid models with both liver and uniquely MRC5 (fetal lung) fibroblasts, we observed co-migration of cells, and a significant increase in length and number of liver spheroid protrusions, and this was highly sensitive to TGFB1 stimulation. To understand paracrine effects between MRC-5 cells and liver, we performed conditioned medium (M-CM) experiments. Interestingly, the addition of M-CM increased liver 3D CCM, with thin, 3D, dose-dependent branching morphogenesis, an upregulation of Twist1, and a sensitivity to a broad TGFB inhibitor. To test the effects of cell-cell interactions of 3D CCM, the STM was modeled with a spheroid of MRC-5 cells, and we performed co-spheroid culture of liver with MRC-5. We observed a complex morphogenesis, whereby thin, linear, 3D liver cell strands attach to the MRC-5 spheroid, anchor, and thicken to form permanent and thick anchoring contacts between the two spheroids. We also observed spheroid fusion, a form of interstitial migration. In conclusion, we present several novel cultivation systems that induce distinct features of 3D CCM, as judged by the presence of branching, linearity, thickness, and interstitial migration. These methodologies will greatly improve our molecular, cellular, and tissue-scale understanding of liver organogenesis, liver diseases, and liver cell therapy, and will serve as a tool to bridge conventional 2D studies and preclinical in vivo studies.

ABSTRACT The shift from collective migration to differentiation is a crucial process in epithelial biology but recreating this intricate transition has thus far proved elusive. We provide experimental, mechanistic, in vivo , and bioinformatic data supporting an undoubtable link between human pluripotent stem cell (hPSC)- derived collectively migrating hepatoblasts (MHB), and transcriptionally mature, functional hPSC- hepatocytes (HEPs), which incorporates two unrecognized steps. The protocol induces FOXA-dependent induction of HBs, leading to TBX3-positive, YAP-TEAD active MHB’s which provide a transcriptional match with murine liver E9.5 MHBs. Simple cultivation changes trigger MHB’s to rapidly form functional day 18 HEPs, predicted by a deep-learning designed gene circuit, resulting in a ∼236% fold- increase in maturation (PACNet), on par with the highest score, but with enhanced global transcriptional shaping. Overall, incorporating the MHB to HEP transition establishes a new, unrecognized, and highly efficient mechanism for differentiation that can be cumulatively integrated with existing methods to overcome barriers to maturation.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, we present a detailed series of methods enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis. In one method series, we utilize assembloid technology with hepatic and mesenchymal spheroids, which replicate early structures found in liver organogenesis, model early morphogenesis, and demonstrate interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. Hepatic spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Fibroblast-conditioned media play a significant role in initiating dose-dependent branching migration. Future work will involve high temporal and spatial resolution imaging of hepatic and mesenchymal interactions to determine the cascade of cellular and molecular events involved in tissue formation, morphogenesis, and migration.

Liver organogenesis has thus far served as a paradigm for solid organ formation, and has recently attracted interest due to challenges faced in liver regenerative medicine. Murine genetic studies indicate that early steps in morphogenesis are required, suggesting that three-dimensional imaging of early liver morphogenesis at high resolution can improve our understanding. Unfortunately, existing approaches to image early liver morphogenesis have been unable to achieve high spatial resolution (1-5 um) required. In this study, we focused on imaging, visualization, and analysis of early liver development. We utilized available online databases for both mouse (EMAP) and human (3D Atlas of Human Embryology) liver development. To visualize liver bud morphogenesis at high spatial resolution, we performed 3D reconstructions of stacked, digital tissue sections. We show dynamic 3D hepatic cord formation in the mouse in humans. Interestingly, when we quantified fetal liver growth, we showed that 3D fetal liver growth appears to occur in spurts rather continuously, and 3D images suggest that there could be considerable remodeling during these stages. Further, our analysis of the STM, in both mouse and humans, demonstrates that it increases in size during early fetal liver growth, that is highly interconnecting with liver epithelium, and that it can have strong local effects on growth. Finally, we identify and visualize and identify human hepatic cord formation followed by rapid sheet-like growth, which we propose could be an under-appreciated morphological feature that enables rapid growth of early human fetal liver. These studies will motivate future approaches to employ in vitro culture and organoid technology to improve human PSC differentiation, and improve disease modeling, and therapeutic opportunities for liver diseases. In conclusion, compared to 2D sectioning, high spatial resolution imaging of the mouse and human 3D liver bud morphogenesis enables greatly improved visualization of the hepatic cords, 3D sheet-like liver cell growth, STM-epithelial cell interactions, and quantitative comparisons between mouse and human liver bud morphogenesis.

FOXA factors are critical members of the developmental gene regulatory network (GRN) composed of master transcription factors (TF) which regulate murine cell fate and metabolism in the gut and liver. How FOXA dictates human liver cell fate, differentiation, and simultaneously regulate metabolic pathways is poorly understood. Here, we aimed to determine the role of FOXA2 (and FOXA1 which is believed to compensate for FOXA2) in hepatic differentiation and cell metabolism in a human hepatic cell line (HepG2). siRNA targeting of FOXA1 and FOXA2 in human hepatic (HepG2) cells and during hepatic differentiation significantly downregulated albumin (p < 0.05) and GRN TF gene expression (HNF4A, HEX, HNF1B, TBX3) (p < 0.05) and significantly upregulated endoderm/gut/hepatic endoderm markers (goosecoid (GSC), FOXA3, and GATA4), gut TF (CDX2), pluripotent TF (NANOG), and neuroectodermal TF (PAX6) (p < 0.05), all consistent with a partial/transient cell reprogramming. shFOXA1/2 targeting resulted in similar findings and demonstrated evidence of reversibility. RNA-seq followed by bioinformatic analysis of shFOXA1/2 knockdown HepG2 cells demonstrated 235 significant downregulated genes and 448 upregulated genes, including upregulation of markers for alternate germ layers lineages (cardiac, endothelial, muscle) and neurectoderm (eye, neural). We found widespread downregulation of glycolysis, citric acid cycle, mitochondrial genes, and alterations in lipid metabolism, pentose phosphate pathway, and ketogenesis. Functional metabolic analysis agreed with these findings, demonstrating significantly diminished glycolysis and mitochondrial respiration, and accumulation of lipid droplets. We hypothesized that FOXA1/2 inhibit the initiation of human liver differentiation in vitro. During hPSC-hepatic differentiation, siRNA knockdown demonstrated de-differentiation and unexpectedly, activation of pluripotency factors and neuroectoderm. shRNA knockdown demonstrated similar results and activation of SOX9 (hepatobiliary). These results demonstrate complex effects of FOXA1/2 on hepatic GRN effecting de-differentiation and metabolism with applications in studies of cancer, differentiation, and organogenesis.