ABSTRACT Multi-scale structural assessment of biological soft tissue is challenging but essential to gain insight into structure-function relationships of tissue/organ. Using the human placenta as an example, this study brings together sophisticated sample preparation protocols, advanced imaging, and robust, validated machine-learning segmentation techniques to provide the first massively multi-scale and multi-domain information that enables detailed morphological and functional analyses of both maternal and fetal placental domains. Finally, we quantify the scale-dependent error in morphological metrics of heterogeneous placental tissue, estimating the minimal tissue scale needed in extracting meaningful biological data. The developed protocol is beneficial for high-throughput investigation of structure-function relationships in both normal and diseased placentas, allowing us to optimise therapeutic approaches for pathological pregnancies. In addition, the methodology presented is applicable in characterisation of tissue architecture and physiological behaviours of other complex organs with similarity to the placenta, where an exchange barrier possesses circulating vascular and avascular fluid spaces.

Human prenatal skin is populated by innate immune cells including macrophages, and whether they act solely in immunity or have additional functions in morphogenesis is unclear. We assembled the first comprehensive multi-omic reference atlas of prenatal human skin (7-16 post-conception weeks), combining single cell and spatial transcriptomic data, to characterise the skin9s microenvironmental cellular organisation. This revealed that crosstalk between non-immune and immune cells underpins formation of hair follicles, has implications for scarless wound healing, and is critical for skin angiogenesis. We benchmarked a skin organoid model, derived from human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells, against prenatal and adult skin, demonstrating close recapitulation of the epidermal and dermal skin components during hair follicle development. Notably, the skin organoid lacked immune cells and had markedly diminished endothelial cell heterogeneity and quantity. From our in vivo skin cell atlas data, we found that macrophages and macrophage-derived growth factors play a key role in driving endothelial development prenatally. Indeed, vascular network formation was enhanced following transfer of autologous iPS-derived macrophages into both endothelial cell angiogenesis assays and skin organoid cultures. In summary, innate immune cells moonlight as key players in skin morphogenesis beyond their conventional immune roles, a function they achieve via extensive crosstalk with non-immune cells. Finally, we leveraged our human prenatal skin cell atlas to further our understanding of the pathogenesis of genetic hair and skin disorders.

Cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) is a potentially fatal clonal malignancy of T cells primarily affecting the skin. The most common form of CTCL, mycosis fungoides (MF), can be difficult to diagnose resulting in treatment delay. The pathogenesis of CTCL is not fully understood due to limited data from patient studies. We performed single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics profiling of skin from patients with MF-type CTCL, and an integrated comparative analysis with human skin cell atlas datasets from healthy skin, atopic dermatitis and psoriasis. We reveal the co-optation of Th2-immune gene programmes by malignant CTCL cells and modelling of the tumour microenvironment to support their survival. We identify MHC-II+ fibroblast subsets reminiscent of lymph node T-zone reticular cells and monocyte-derived dendritic cells that can maintain Th2-like tumour cells. CTCL Th2-like tumour cells are spatially associated with B cells, forming aggregates reminiscent of tertiary lymphoid structures which are more prominent with progressive disease. Finally, we validated the enrichment of B cells in CTCL skin infiltrates and its association with disease progression across three independent patient cohorts. Our findings provide diagnostic aids, potential biomarkers for disease staging and therapeutic strategies for CTCL.

Abstract Electron cryo-tomography (cryo-ET) is an imaging technique for probing 3D structures with at the nanometre scale. This technique has been used extensively in the biomedical field to study the complex structures of proteins and other macromolecules. With the advancement in technology, microscopes are currently capable of producing images amounting to terabytes of data per day, posing great challenges for scientists as the speed of processing of the images cannot keep up with the ever-higher throughput of the microscopes. Therefore, automation is an essential and natural pathway on which image processing – from individual micrographs to full tomograms – is developing. In this paper, we present Ot2Rec, an open-source pipelining tool which aims to enable scientists to build their own processing workflows in a flexible and automatic manner. The basic building blocks of Ot2Rec are plugins which follow a unified API structure, making it simple for scientists to contribute to Ot2Rec by adding features which are not already available. In this paper, we also present three case studies of image processing using Ot2Rec, through which we demonstrate the speedup of using a semi-automatic workflow over a manual one, the possibility of writing and using custom (prototype) plugins, and the flexibility of Ot2Rec which enables the mix-and-match of plugins. We also demonstrate, in the supplementary information, a built-in reporting feature in Ot2Rec which aggregates the metadata from all process being run, and output them in the Jupyter Notebook and/or HTML formats for quick review of image processing quality. Ot2Rec can be found at https://github.com/rosalindfranklininstitute/ot2rec . Impact Statement The field of cryo electron tomography has grown substantially in recent years, bringing about new advances in hardware and software which enable visualisation of cell and tissue architecture and proteins found in their native context. These same advances have, in some ways, stratified the field into those with access and those without. On the software side, this has emphasised the need for open-source options that do not require high levels of computational literacy to access. Additionally, it has highlighted the need for ways to both mix-and-match software for easy prototyping and comparisons between parameters and methods. Ot2Rec addresses these needs through a simple, unified plugin structure allowing the addition of existing software or the development of new and does so in a way which democratises access.