Notch receptor signaling pathways play an important role not only in normal breast development but also in breast cancer development and progression. We assessed the role of Notch receptors in stem cell activity in breast cancer cell lines and nine primary human tumor samples. Stem cells were enriched by selection of anoikis-resistant cells or cells expressing the membrane phenotype ESA(+)/CD44(+)/CD24(low). Using these breast cancer stem cell populations, we compared the activation status of Notch receptors with the status in luminally differentiated cells, and we evaluated the consequences of pathway inhibition in vitro and in vivo. We found that Notch4 signaling activity was 8-fold higher in stem cell-enriched cell populations compared with differentiated cells, whereas Notch1 signaling activity was 4-fold lower in the stem cell-enriched cell populations. Pharmacologic or genetic inhibition of Notch1 or Notch4 reduced stem cell activity in vitro and reduced tumor formation in vivo, but Notch4 inhibition produced a more robust effect with a complete inhibition of tumor initiation observed. Our findings suggest that Notch4-targeted therapies will be more effective than targeting Notch1 in suppressing breast cancer recurrence, as it is initiated by breast cancer stem cells.

Abstract Breast cancer remains a leading cause of mortality, predominantly due to the development of metastases to vital organs. At present, predictive biomarkers of organ specific metastasis and therapies targeted to the metastatic niche are limited. Here, to identify the molecular determinants of breast cancer metastasis we analysed patient-derived breast tumours by combining quantitative proteomics, bioinformatics, and functional assays in vitro and in vivo. We identified elevated levels of the protein Osteomodulin (OMD) associated with breast cancer bone metastases in patient-derived samples. OMD overexpression in the breast cancer MDA-MB-231 cell model significantly increases cell migration in vitro and promotes the formation of bone metastases in vivo . Phosphoproteomics analysis of MDA-MB-231 cells expressing OMD identifies active Cyclin-dependent kinase 1 (CDK1) downstream of OMD. The importance of the OMD-CDK1 axis was validated using two independent phosphoproteomics datasets analysing patient-derived breast cancer samples. We also show that the OMD-CDK1 axis drives cell migration and cell viability in vitro and the formation of bone metastases in vivo . Finally, CDK1 inhibition reduces in vitro cell viability of an independent cohort of metastatic patient samples showing high CDK1 activity. Therefore, the OMD-CDK1 axis will determine which breast cancer patients develop bone metastases and is a therapeutic target to treat or prevent breast cancer bone metastases.

Hypoxia stimulates metastasis in cancer and is linked to poor patient prognosis. In tumours, oxygen levels vary and hypoxic regions exist within a generally well-oxygenated tumour. However whilst the heterogeneous environment is known to contribute to metastatic progression, little is known about the mechanism by which heterogeneic hypoxia contributes to cancer progression. This is largely because existing experimental models do not recapitulate the heterogeneous nature of hypoxia. The primary effector of the hypoxic response is the transcription factor Hypoxia inducible factor 1-alpha (HIF1-alpha). HIF1-alpha is induced in response to low oxygen levels in the cellular environment. We have therefore developed a model system in which HIF1-alpha can be specifically induced within subsets of cancer cells, thus enabling us to mimic the effects of heterogeneic HIF1-alpha expression induced by heterogeneic hypoxia. We show that induction of HIF1-alpha not only recapitulates the hypoxic response in the induced cells but also results in significant changes in proliferation, gene expression and cancer stem cell production within the non-HIF1-alpha expressing population. These findings suggest that the HIF1-alpha expressing cells found within hypoxic regions may have a profound effect on the behaviour of cells within non-hypoxic regions. As these effects are likely to contribute to the subsequent progression of a tumour further investigation is required to understand this interaction.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a dynamic process that drives cancer cell plasticity and is thought to play a major role in metastasis. Here we show that the plasticity of metastatic breast cancer cells can be promoted by the activity of the RUNX transcription factors. We demonstrate that the RUNX co-regulator CBFβ is essential to maintain the mesenchymal phenotype of triple-negative breast cancer cells and that CBFβ-depleted cells undergo a mesenchymal to epithelial transition (MET) and re-organise into acini-like structures, reminiscent of those formed by epithelial breast cells. We subsequently show, using an inducible CBFβ system, that the MET can be reversed, thus demonstrating the plasticity of RUNX/CBFβ-mediated EMT. Moreover, the MET can be reversed by expression of the EMT transcription factor Slug whose expression is dependent on CBFβ, RUNX1 and RUNX2. Finally, we demonstrate that loss of CBFβ inhibits the ability of metastatic breast cancer cells to invade bone cell cultures and suppresses their ability to form bone metastases in vivo. Together our findings demonstrate that the RUNX/CBFβ complexes can determine the plasticity of the metastatic cancer cell phenotypes, suggesting that their regulation in different micro-environments may play a key role in the establishment of metastatic tumours.