Several different agricultural insect pests have developed field resistance to Bt (Bacillus thuringiensis) proteins (ex. Cry1Ac, Cry1F, etc.) expressed in crops, including corn and cotton. In the bollworm, Helicoverpa zea, resistance levels are increasing; recent reports in 2019 show up to 1000-fold levels of resistance to Cry1Ac, a major insecticidal protein in Bt-crops. A common method to analyze global differences in gene expression is RNA-seq. This technique was used to measure differences in global gene expression between a Bt-susceptible and Bt-resistant strain of the bollworm, where the differences in susceptibility to Cry1Ac insecticidal proteins were 100-fold. We found expected gene expression differences based on our current understanding of the Bt mode of action, including increased expression of proteases (trypsins and serine proteases) and reduced expression of Bt-interacting receptors (aminopeptidases and cadherins) in resistant bollworms. We also found additional expression differences for transcripts that were not previously investigated, i.e., transcripts from three immune pathways-Jak/STAT, Toll, and IMD. Immune pathway receptors (ex. PGRPs) and the IMD pathway demonstrated the highest differences in expression. Our analysis suggested that multiple mechanisms are involved in the development of Bt-resistance, including potentially unrecognized pathways.

The bollworm, Helicoverpa zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuidae), is an important agricultural pest in U.S. cotton and is managed using transgenic hybrids that produce insecticidal proteins from the bacterium, Bacillus thuringiensis (Bt). The reduced efficacy against H. zea caterpillars of Bt plants expressing Cry toxins is increasing in the field. In a first step towards understanding Bt cotton–bollworm–microbiota interactions, we investigated the internal bacterial microbiota of second–third stadium H. zea collected in the field from non-Bt versus Bt (WideStrike) cotton in close proximity (in North Carolina, USA). The bacterial populations were analyzed using culture-dependent and -independent molecular approaches. We found that WideStrike samples had a higher bacterial density and diversity per larva than insects collected from non-Bt cotton over two field seasons: 8.42 ± 0.23 and 5.36 ± 0.75 (log10 colony forming units per insect) for WideStrike compared to 6.82 ± 0.20 and 4.30 ± 0.56 for non-Bt cotton for seasons 1 and 2, respectively. Fifteen phyla, 103 families, and 229 genera were identified after performing Illumina sequencing of the 16S rRNA. At the family level, Enterobacteriaceae and Enterococcaceae were the most abundant taxa. The Enterococcaceae family was comprised mostly of Enterococcus species (E. casseliflavus and another Enterococcus sp.). Members of the Enterococcus genus can acidify their environment and can potentially reduce the alkaline activation of some Bt toxins. These findings argue for more research to better understand the role of cotton–bollworm–bacteria interactions and the impact on Bt toxin caterpillar susceptibility.

Multiple insect pest species have developed field resistance to Bt-transgenic crops. There has been a significant amount of research on protein-coding genes that contribute to resistance, such as the up-regulation of protease activity or altered receptors. However, our understanding of the role of non-protein-coding mechanisms in Bt-resistance is minimal, as is also the case for resistance to chemical pesticides. To address this problem relative to Bt, RNA-seq was used to examine statistically significant, differential gene expression between a Cry1Ac-resistant (~100-fold resistant) and Cry1Ac-susceptible strain of Helicoverpa zea, a prevalent caterpillar pest in the USA. Significant differential expression of putative long non-coding RNAs (lncRNAs) was found in the Cry1Ac-resistant strain (58 up- and 24 down-regulated gene transcripts with an additional 10 found only in resistant and four only in susceptible caterpillars). These lncRNAs were examined as potential pseudogenes and for their genomic proximity to coding genes, both of which can be indicative of regulatory relationships between a lncRNA and coding gene expression. A possible pseudogenic lncRNA was found with similarities to a cadherin. In addition, putative lncRNAs were found significantly proximal to a serine protease, ABC transporter, and CYP coding genes, potentially involved in the mechanism of Bt and/or chemical insecticide resistance. Characterization of non-coding genetic mechanisms in Helicoverpa zea will improve the understanding of the genomic evolution of insect resistance, improve the identification of specific regulators of coding genes in general (some of which could be important in resistance), and is the first step for potentially targeting these regulators for pest control and resistance management (using molecular approaches, such as RNAi and others).

Human exposure to environmental chemicals both individually and in combination occurs frequently world-wide most often with unknown consequences. Use of molecular approaches to aide in the assessment of risk involved in chemical exposure is a growing field in toxicology. In this study, we examined the impact of two environmental chemicals used in and around homes, the insect repellent DEET (N,N-diethyl-m-toluamide) and the phenylpyrazole insecticide fipronil (fluocyanobenpyrazole) on transcript levels of enzymes potentially involved in xenobiotic metabolism and on long non-coding RNAs (lncRNAs). Primary human hepatocytes were treated with these two chemicals both individually and in combination. Using RNA-Seq, we found that 10 major enzyme categories involved in phase 1 and phase 2 xenobiotic metabolism were significantly (α = 0.05) up- and down-regulated (i.e., 100 μM DEET–19 transcripts, 89% up and 11% down; 10 μM fipronil–52 transcripts, 53% up and 47% down; and 100 μM DEET +10 μM fipronil–69 transcripts, 43% up and 57% down). The altered genes were then mapped to the human genome and their proximity (within 1,000,000 bp) to lncRNAs examined. Unique proximities were discovered between altered lncRNA and altered P450s (CYP) and other enzymes (DEET, 2 CYP; Fipronil, 6 CYP and 15 other; and DEET + fipronil, 7 CYP and 21 other). Many of the altered P450 transcripts were in multiple clusters in the genome with proximal altered lncRNAs, suggesting a regulator function for the lncRNA. At the gene level there was high percent identity for lncRNAs near P450 clusters, but this relationship was not found at the transcript level. The role of these altered lncRNAs associated with xenobiotic induction, human diseases and chemical mixtures is discussed.

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) are variations that occur at single nucleotides in the genome and are present at an appreciable level in a population. SNPs can be linked to phenotypes of interest, for example diseases, recent adaptations, or species hybridization. They can also be used to study phylogeny and evolutionary history. Technologies that rapidly identify and catalog the presence of SNPs in a DNA sample are known as SNP genotyping panels, and they continue to undergo rapid development. Such methods have great utility across the agricultural sciences in diverse areas such as plant and animal breeding, pathogen and pesticide resistance identification, outbreak tracing, and hybridization detection. Here, we provide an overview of 14 different SNP genotyping technologies and weigh some of the pros and cons associated with each platform. This review is not comprehensive or technical, nor does it aim to be. Rather, the objective is to provide an introduction to the landscape of genotyping technologies for researchers who do not have experience with these methods. Three classes of SNP genotyping methods are Polymerase Chain Reaction (PCR)-based (nine different methods), microarray-based (one method), and Next-Generation Sequencing (NGS)-based (four different methods). We discuss how each genotyping class is suited for different niches; PCR-based has a low SNP count and high sample number, microarray-based has a very high SNP count and a moderate sample number, and Next-Generation Sequencing-based has a moderate SNP count and moderate number of samples. Included are basics about how the methods function and example use cases of each method. Additionally, we introduce and discuss the potential for the MinION sequencer in SNP genotyping. For each technology, we provide insights into cost, equipment needs, labor costs, experimental complexity, data output complexity, and accessibility. These considerations address the feasibility of deploying the technologies in an agricultural science environment.

Rapid, accurate insect identification is the first and most critical step of pest management and vital to agriculture for determining optimal management strategies. In many instances, classification is necessary within a short developmental window. Two examples, the tobacco budworm, Chloridea virescens, and bollworm, Helicoverpa zea, both have <5 days from oviposition until hatching. H. zea has evolved resistance to Bt-transgenic crops and requires farmers to decide about insecticide application during the ovipositional window. The eggs of these species are small, approximately 0.5 mm in diameter, and often require a trained biologist and microscope to resolve morphological differences between species. In this work, we designed, built, and validated a machine learning approach to insect egg identification with >99% accuracy using a convolutional neural architecture to classify the two species of caterpillars. A gigapixel scale parallelized microscope, referred to as the Multi-Camera Array Microscope (MCAM™), and automated image-processing pipeline allowed us to rapidly build a dataset of ~5500 images for training and testing the network. In the future, applications could be developed enabling farmers to photograph eggs on a leaf and receive an immediate species identification before the eggs hatch.

Sand flies (Diptera: Psychodidae) serve as vectors for transmitting protozoan parasites, Leishmania spp., that cause the disease called leishmaniasis. The main approach to controlling sand flies is the use of chemical insecticides. The discovery of alternative methods for their control is needed because of potential health risks of chemical insecticides and development of sand fly resistance to these pesticides. The biomineral produced by diatoms (diatomaceous earth, DE; Celite) and a volcanic glass bio-mimic (Imergard) have been shown by our group to be efficacious against mosquitoes, filth flies, and ticks but never studied for the control of sand flies. In a modified World Health Organization cone test, 50% of adult Phlebotomus papatasi sand flies at 29 ± 1 °C, 55 ± 5% RH, and 12:12 LD, when exposed to Imergard and Celite, were dead in 13.08 and 7.57 h, respectively. Proof of concept was established for the use of these biominerals for sand fly and leishmaniasis disease control. Using a light source as an attractant to the minerals had no significant effect on the LT50, the time to 50% mortality. The LT50 at a higher relative humidity of 70 ± 5% increased to 20.91 and 20.56 h for Imergard and Celite, respectively, suggesting their mode of action was dehydration. Scanning electron microscopy of dead sand flies showed high coating levels of Celite only on the sides of the thorax and on the tarsi, suggesting an alternative mode of action for mechanical insecticides.

Abstract Helicoverpa armigera , the cotton bollworm moth, is one of the world’s most important crop pests, and is spreading throughout the New World from its original range in the Old World. In Brazil, invasive H.armigera has been reported to hybridize with local populations of Helicoverpa zea . The correct identification of H.armigera-H.zea hybrids is important in understanding the origin, spread and future outlook for New World regions that are affected by outbreaks, given that hybridization can potentially facilitate H.zea pesticide resistance and host plant range via introgression of H.armigera genes. Here, we present a genome admixture analysis of high quality genome sequences generated from two H.armigera-H.zea F1 hybrids generated in two different labs. Our admixture pipeline predicts 48.8 % H.armigera for both F1 hybrids, confirming its accuracy. Genome sequences from five H.zea and one H.armigera that were generated as part of the study show no evidence of hybridization. Interestingly, we show that four H.zea genomes generated from a previous study are predicted to possess a proportion of H.armigera genetic material. Using unsupervised clustering to identify non-hybridized H.armigera and H.zea genomes, 8511 ancestry informative markers (AIMs) were identified. Their relative frequencies are consistent with a minor H.armigera component in the four genomes, however its origin remains to be established. We show that the size and quality of genomic reference datasets are critical for accurate hybridization prediction. Consequently, we discuss potential pitfalls in genome admixture analysis of H . armigera-H.zea hybrids, and suggest measures that will improve such analyses.

, the cotton bollworm moth, is one of the world's most important crop pests, and is spreading throughout the New World from its original range in the Old World. In Brazil, invasive