Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) is prominently overexpressed after myocardial infarction (MI). We tested the hypothesis that mice with targeted deletion of MMP9 have less left ventricular (LV) dilation after experimental MI than do sibling wild-type (WT) mice. Animals that survived ligation of the left coronary artery underwent echocardiographic studies after MI; all analyses were performed without knowledge of mouse genotype. By day 8, MMP9 knockout (KO) mice had significantly smaller increases in end-diastolic and end-systolic ventricular dimensions at both midpapillary and apical levels, compared with infarcted WT mice; these differences persisted at 15 days after MI. MMP-9 KO mice had less collagen accumulation in the infarcted area than did WT mice, and they showed enhanced expression of MMP-2, MMP-13, and TIMP-1 and a reduced number of macrophages. We conclude that targeted deletion of the MMP9 gene attenuates LV dilation after experimental MI in mice. The decrease in collagen accumulation and the enhanced expression of other MMPs suggest that MMP-9 plays a prominent role in extracellular matrix remodeling after MI.

Background— Arterial calcification is associated with cardiovascular events; however, mechanisms of calcification in atherosclerosis remain obscure. Methods and Results— We tested the hypothesis that inflammation promotes osteogenesis in atherosclerotic plaques using in vivo molecular imaging in apolipoprotein E −/− mice (20 to 30 weeks old, n=35). A bisphosphonate-derivatized near-infrared fluorescent imaging agent (excitation 750 nm) visualized osteogenic activity that was otherwise undetectable by x-ray computed tomography. Flow cytometry validated the target specifically in osteoblast-like cells. A spectrally distinct near-infrared fluorescent nanoparticle (excitation 680 nm) was coinjected to simultaneously image macrophages. Fluorescence reflectance mapping demonstrated an association between osteogenic activity and macrophages in aortas of apolipoprotein E −/− mice ( R 2 =0.93). Intravital dual-channel fluorescence microscopy was used to further monitor osteogenic changes in inflamed carotid arteries at 20 and 30 weeks of age and revealed that macrophage burden and osteogenesis concomitantly increased during plaque progression ( P <0.01 and P <0.001, respectively) and decreased after statin treatment ( P <0.0001 and P <0.05, respectively). Fluorescence microscopy on cryosections colocalized near-infrared fluorescent osteogenic signals with alkaline phosphatase activity, bone-regulating protein expression, and hydroxyapatite nanocrystals as detected by electron microscopy, whereas von Kossa and alizarin red stains showed no evidence of calcification. Real-time reverse-transcription polymerase chain reaction revealed that macrophage-conditioned media increased alkaline phosphatase mRNA expression in vascular smooth muscle cells. Conclusions— This serial in vivo study demonstrates the real-time association of macrophage burden with osteogenic activity in early-stage atherosclerosis and offers a cellular-resolution tool to identify preclinical microcalcifications.

Background —Unstable atherosclerotic plaques that cause acute coronary events usually contain abundant macrophages expressing matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue factor (TF), molecules that probably contribute to plaque rupture and subsequent thrombus formation. Lipid lowering with HMG-CoA reductase inhibitors reduces acute coronary events. Methods and Results —To test whether lipid lowering with an HMG-CoA reductase inhibitor retards macrophage accumulation in rabbit atheroma, we administered cerivastatin to immature Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits (cerivastatin group, n=10, cerivastatin 0.6 mg · kg −1 · d −1 ; control group, n=9, saline 0.6 mL · kg −1 · d −1 ) for 32 weeks and measured macrophage accumulation and expression of MMPs and TF. Serum cholesterol levels after 32 weeks were 809±40 mg/dL (control group) and 481±24 mg/dL (treated group). Cerivastatin diminished accumulation of macrophages in aortic atheroma. Macrophage expression of MMP-1, MMP-3, MMP-9, and TF also decreased with cerivastatin treatment. Cerivastatin reduced the number of macrophages expressing histone mRNA (a sensitive marker of cell proliferation) detected by in situ hybridization but did not alter macrophages bearing a marker of death (TUNEL staining). Cerivastatin treatment (≥0.01 μmol/L) also reduced growth, proteolytic activity due to MMP-9, and TF expression in cultured human monocyte/macrophages. Conclusions —These results suggest that lipid lowering with HMG-CoA reductase inhibitors alters plaque biology by reducing proliferation and activation of macrophages, prominent sources of molecules responsible for plaque instability and thrombogenicity.

Background The mechanisms of extracellular matrix changes accompanying myxomatous valvular degeneration are uncertain. Methods and Results To test the hypothesis that valvular interstitial cells mediate extracellular matrix degradation in myxomatous degeneration by excessive secretion of catabolic enzymes, we examined the functional characteristics of valvular interstitial cells in 14 mitral valves removed for myxomatous degeneration from patients with mitral regurgitation and in 11 normal mitral valves obtained at autopsy. Immunohistochemical staining assessed (1) cell phenotype using antibodies to α-actin (microfilaments), vimentin and desmin (intermediate filaments), smooth muscle myosin (SM1), and SMemb (a nonmuscle myosin produced by activated mesenchymal cells) and (2) the expression of proteolytic activity using antibodies to collagenases (matrix metalloproteinase [MMP]-1, MMP-13), gelatinases (MMP-2, MMP-9), cysteine endoproteases (cathepsin S and K), and interleukin-1β, a cytokine that can induce secretion of proteolytic enzymes. Although interstitial cells in normal valves stained positively for vimentin, but not α-actin or desmin, cells in myxomatous valves contained both vimentin and α-actin or desmin (characteristics of myofibroblasts). Moreover, cells in myxomatous valves strongly expressed SMemb, MMPs, cathepsins, and interleukin-1β, which were weakly stained in controls. Nevertheless, interstitial cells in both groups strongly expressed procollagen-I mRNA (in situ hybridization), suggesting preserved ability to synthesize collagen in myxomatous valves. Conclusions Interstitial cells in myxomatous valves have features of activated myofibroblasts and express excessive levels of catabolic enzymes, without altered levels of interstitial collagen mRNA. We conclude that valvular interstitial cells regulate matrix degradation and remodeling in myxomatous mitral valve degeneration.

Invasion of erythrocytes by merozoites of the monkey malaria, Plasmodium knowlesi, was investigated by electron microscopy. The apical end of the merozoite makes initial contact with the erythrocyte, creating a small depression in the erythrocyte membrane. The area of the erythrocyte membrane to which the merozoite is attached becomes thickened and forms a junction with the plasma membrane of the merozoite. As the merozoite enters the invagination in the erythrocyte surface, the junction, which is in the form of a circumferential zone of attachment between the erythrocyte and merozoite, moves along the confronted membranes to maintain its position at the orifice of the invagination. When entry is completed, the orifice closes behind the parasite in the fashion of an iris diaphragm, and the junction becomes a part of the parasitophorous vacuole. The movement of the junction during invasion is an important component of the mechanism by which the merozoite enters the erythrocyte. The extracellular merozoite is covered with a prominent surface coat. During invasion, this coat appears to be absent from the portion of the merozoite within the erythrocyte invagination, but the density of the surface coat outside the invagination (beyond the junction) is unaltered.

Proteolytic enzyme activity in lipid-rich atheroma may promote plaque rupture and precipitate acute coronary syndromes. This study tested the hypothesis that lipid lowering stabilizes plaques by reducing proteolytic activity.We produced experimental atheroma in 33 rabbits by balloon injury and an atherogenic diet (0.3% cholesterol and 4.7% coconut oil) for 4 months. At that time, 15 rabbits were killed (baseline group). The remaining animals were divided into two groups: a hyperlipemic group continued to consume a cholesterol-enriched diet (0.05% to 0.2%) for 16 more months (n=5) and a lipid-lowering group consumed a purified chow diet with no added cholesterol or fat for 8 (n=3) or 16 months (n=10). Macrophage accumulation and interstitial collagenase (matrix metalloproteinase-1, MMP-1) expression in the lesion were measured by quantitative image analysis of standardized sections of immunostained aortas. Baseline lesions expressed high levels of MMP-1 and contained many macrophages. These features of plaque instability persisted in the hyperlipemic group. However, the lipid-lowering group showed progressive reduction in both macrophage content and MMP- 1 immunoreactivity with time. Aortic rings of the baseline and hyperlipemic groups elaborated gelatinolytic, caseinolytic, and elastinolytic activity attributable to MMP-2, MMP-3, or MMP-9, monitored by SDS-PAGE zymography. Proteolytic activity decreased markedly in the lipid-lowering group. Aortic content of interstitial collagen, determined by sirius red staining, increased in the lipid-lowering group compared with the baseline or continued hyperlipemic groups, indicating that lipid lowering reinforced the fibrous skeleton of the atheroma.These results establish a mechanism by which lipid lowering may stabilize vulnerable plaques by reduced expression and activity of enzymes that degrade the arterial extracellular matrix and render atheroma less susceptible to disruption and thrombosis by favoring collagen accumulation in the fibrous cap.

Extracellular matrix synthesis and degradation contribute to the morphological changes that occur after myocardial infarction (MI).We tested the hypothesis that inhibition of matrix metalloproteinases (MMPs) attenuates left ventricular remodeling in experimental MI. Seventy-one male FVB mice that survived ligation of the left anterior coronary artery were randomized to a broad-spectrum MMP inhibitor (CP-471,474) or placebo by gavage. Echocardiographic studies were performed before randomization (within 24 hours of surgery) and 4 days later and included short-axis imaging at the midpapillary and apical levels. Infarction as defined by wall motion abnormality was achieved in 79% of the procedures (n=56), and mortality rate during the 4-day protocol was 23% (9 of 36 on treatment vs 7 of 35 on placebo; P=NS). Baseline end-diastolic and end-systolic dimensions and areas were similar (P=NS) between treated and placebo groups. At follow-up, infarcted mice allocated to MMP inhibitor had significantly smaller increases in end-systolic and end-diastolic dimensions and areas at both midpapillary and apical levels compared with infarcted mice allocated to placebo (all P<0.05). In addition, infarcted animals that received MMP inhibitor had no change in fractional shortening (-3+/-13%), whereas animals that received placebo had a decrease in fractional shortening (-12+/-12%) (P<0.05). In an analysis stratified by baseline end-diastolic area, the effects of MMP inhibition on the changes in end-systolic area and end-diastolic area were most prominent in animals that had more initial left ventricular dilatation (both P<0.05).-Administration of an MMP inhibitor attenuates early left ventricular dilation after experimental MI in mice. Further studies in genetically altered mice and other models will improve understanding of the role of MMPs in left ventricular remodeling.

Background— Visualizing early changes in valvular cell functions in vivo may predict the future risk and identify therapeutic targets for prevention of aortic valve stenosis. Methods and Results— To test the hypotheses that (1) aortic stenosis shares a similar pathogenesis to atherosclerosis and (2) molecular imaging can detect early changes in aortic valve disease, we used in vivo a panel of near-infrared fluorescence imaging agents to map endothelial cells, macrophages, proteolysis, and osteogenesis in aortic valves of hypercholesterolemic apolipoprotein E–deficient mice (30 weeks old, n=30). Apolipoprotein E–deficient mice with no probe injection (n=10) and wild-type mice (n=10) served as controls. Valves of apolipoprotein E–deficient mice contained macrophages, were thicker than wild-type mice ( P <0.001), and showed early dysfunction detected by MRI in vivo. Fluorescence imaging detected uptake of macrophage-targeted magnetofluorescent nanoparticles (24 hours after injection) in apolipoprotein E–deficient valves, which was negligible in controls ( P <0.01). Valvular macrophages showed proteolytic activity visualized by protease-activatable near-infrared fluorescence probes. Ex vivo magnetic resonance imaging enhanced with vascular cell adhesion molecule-1–targeted nanoparticles detected endothelial activation in valve commissures, the regions of highest mechanical stress. Osteogenic near-infrared fluorescence signals colocalized with alkaline phosphatase activity and expression of osteopontin, osteocalcin, Runx2/Cbfa1, Osterix, and Notch1 despite no evidence of calcium deposits, which suggests ongoing active processes of osteogenesis in inflamed valves. Notably, the aortic wall contained advanced calcification. Quantitative image analysis correlated near-infrared fluorescence signals with immunoreactive vascular cell adhesion molecule-1, macrophages, and cathepsin-B ( P <0.001). Conclusions— Molecular imaging can detect in vivo the key cellular events in early aortic valve disease, including endothelial cell and macrophage activation, proteolytic activity, and osteogenesis.

Objective— Superficial erosion of coronary plaques due to endothelial loss causes acute coronary syndromes (ACS). Macrophages at erosive sites of human coronary atheroma present myeloperoxidase (MPO), an enzyme that produces hypochlorous acid (HOCl). Methods and Results— Activated MPO-positive macrophages or exogenous HOCl promoted detachment of endothelial cells (EC) from “Matrigel” substrata in vitro. Pathophysiologically relevant concentrations of HOCl caused EC death in a concentration-dependent manner: HOCl (20 to 50 μmol/L) induced rapid shrinkage of EC with nuclear condensation and disruption of EC monolayers, whereas concentrations >100 μmol/L immediately induced blebbing of the EC plasma membrane without shrinkage. HOCl (30 to 50 μmol/L) also induced caspase-3 activation, poly (ADP-ribose) polymerase degradation, and DNA laddering in EC. HOCl rapidly decreased endothelial Bcl-2 and induced cytochrome-C release, indicating that HOCl activates apoptotic EC death, partially via mitochondrial damage. Increased intracellular glutathione (GSH) levels after treatment with GSH monoethyl ester (GSH-MEE) attenuated HOCl-induced EC apoptosis. Sublethal concentrations of HOCl (1.0 to 15 μmol/L) increased tissue factor in EC and GSH-MEE treatment limited this effect of HOCl. Conclusions— HOCl can provoke EC death and desquamation by either apoptotic or oncotic cell-death pathways, and sublethal concentrations of HOCl can increase endothelial tissue factor. These results show that MPO-positive macrophage-derived HOCl in the subendothelium of atheromata may participate in ACS by promoting superficial erosion and increasing thrombogenicity.