Current studies of biological tissues require visualizing diverse cell types and molecular interactions, creating a growing need for versatile techniques to simultaneously probe numerous targets. Traditional multiplexed imaging is limited to around five targets at once. Emerging methods utilizing sequential rounds of staining, imaging, and signal removal can probe tens of targets but require specialized hardware, time-consuming workflows, and face some challenges with sample distortion and artifacts. Here we present a new method for highly-multiplexed fluorescence microscopy using semiconducting polymer dots (Pdots) in a single round of staining and imaging. Pdots are small, bright, and photostable fluorescent probes with a wide range of tunable Stokes shifts (20-450 nm). Multiple series of Pdots with varying excitation wavelengths allow for fast (<1 minute) and single-round imaging of up to 21 targets in brain and kidney. This method is based on a simple immunofluorescence workflow, efficient use of spectral space, standard hardware, and straightforward analysis, making it widely applicable for bioimaging laboratories.

Renal glomeruli have traditionally been studied by micrometer-scale optical microscopy to interrogate overall physiology or molecular distributions and by nanoscale electron microscopy to interrogate the ultrastructure of thin sections. While these approaches are powerful, they have been limited in their ability to obtain detailed views of the glomeruli as holistic 3D functional units. To fill this knowledge gap, we have developed a novel pipeline for imaging, reconstructing, and analyzing whole mouse glomeruli at 100 nm resolution using super-resolution fluorescence microscopy. This pipeline integrates both manual and machine learning approaches to annotate and analyze glomerular structures. Using this method, we created 18 detailed glomerulus models, from a range of healthy, aged, and model diseased mice, that outline all major structures and cell types. These models have been made publicly accessible in an online repository, providing a valuable resource for further studies. Our results also uncovered a diverse set of novel phenotypes including nuclear enlargement in all glomerular cell types in aging and disease, as well as an aging-related pattern of regional thickening of the Bowman's capsule basement membrane near the tubular-glomerular junction.