Background: We recently demonstrated that the procoagulant activity of skeletal muscle myosin (SkM) involved the binding of coagulation factor (F) XI to enhance FXI activation by thrombin. However, the impact of SkM on the enzymatic activities of activated FXI (FXIa) remains unclear. Aims: Determine the influence of SkM interactions on the expression of FXIa activities. Methods: Binding studies between FXIa and SkM were conducted using biolayer interferometry (BLI). Kallikrein, a FXIa homolog, served as a negative control. The interactions between SkM and FXIa were investigated through fluorescence spectroscopy using dansyl-labeled FXIa. Chromogenic assays for FXIIa were employed to measure FXII activation by FXIa. Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) inactivation by FXIa was assessed by determining FXa inhibition by TFPI using FX chromogenic assays. Quantification of complement factor H (CFH) cleavage by FXIa as well as FV activation by FXIa were carried out using SDS PAGE and Coomassie blue staining. Results: BLI data showed that SkM exhibited a high binding affinity for FXIa with a dissociation constant of 1.6 nM, whereas SkM did not bind kallikrein. The addition of SkM induced a 9 nm shift in the emission spectrum of dansyl-labeled FXIa. The presence of SkM increased the rate of feedback FXII activation by FXIa but not by kallikrein. The addition of SkM inhibitors, trifluoperazine and blebbistatin, reduced the enhancement effect of SkM on the ability of FXIa to activate FXII. Furthermore, SkM increased the rate of enzymatic inactivation of TFPI by FXIa, the rate of cleavage of CFH by FXIa, and the rate of activation of FV by FXIa. Conclusions: SkM binds with high affinity to FXIa and serves as a co-factor to enhance multiple different enzymatic activities of FXIa. Future work is needed to examine the multiple procoagulant activities of SkM in the setting of hemostasis and acute trauma.

Background: Lipopolysaccharide (LPS) is the primary pathogenic factor in Gram-negative sepsis. LPS is a polyanionic molecule that may act as a site of initiation of coagulation by activating factor (F)XII. While the physicochemical properties of LPS are known to be sensitive to interactions with divalent cations, it is unknown whether divalent cations modulate the activation of FXII by LPS. Aims: To determine whether divalent cations regulate the kinetics of FXII activation by select LPS chemotypes from E. coli . Methods: Aggregates of E. Coli LPS chemotypes O26:B6 and Rd2 were prepared in ultrapure water in the presence or absence of calcium (Ca 2+ ). The biophysical characterization of LPS chemotypes were determined by dynamic light scattering (DLS) and measurement of zeta potential (ZP). Chromogenic substrate assays were used to study the effects of LPS on FXII activation. Results: The LPS O26:B6 and Rd2 in the absence of Ca 2+ produced aggregates in form of micelles with hydrodynamic diameters of 190±10 and 200±7 nm and ZP of -25±0.8 and -60±2 mV, respectively. The presence of Ca 2+ produced aggregates in the form of vesicles with hydrodynamic diameters of 400±15 and 1300±60 nm and ZP of –11±2 and –3±0.5 mV, respectively. FXII was incubated in HEPES buffer with the distinct LPS morphologies in varying salt concentrations. We found maximal autoactivation of FXII by O26:B6 and Rd2 chemotypes at lower NaCl concentrations. The presence of Ca 2+ , however, selectively reduced the ability of O26:B6 to activate FXII. Strikingly, the neutralization of the surface net charge of the LPS chemotype Rd2 by Ca 2+ ions abrogated the amidolytic activity of Rd2. Conclusions: The presence of calcium ions induces changes in the physicochemical properties of LPS that result in distinct effects on FXII activation in vitro . We are currently studying whether this phenomena is conserved for other divalent cations including Zn, Mg, Cu, and Mn.

Background: Amniotic fluid (AF) embolism is one of the most catastrophic complications during pregnancy. While studies primarily attributed the procoagulability of AF to circulating tissue factor (TF), the exact mechanism remains unclear. Aims: Define the procoagulant mechanisms of AF. Methods: Clotting time assays were performed using normal human plasma or plasma depleted of factor (F)XII, XI, X, IX, VII, V, or prekallikrein (PK). Chromogenic substrate assays were used to quantify FX activation by the TF/FVIIa complex and prothrombin activation by FXa. Phosphatidylserine (PS) levels were quantified using a fluorometric kit. Results: AF shortened the clotting time of normal plasma from 572±83 to 160±2 seconds; AF-induced clotting times were equivalent for FXII, PK, FXI, FX, FIX, or FV-depleted plasma or in the presence of contact pathway inhibitors as compared to normal plasma. In contrast, the procoagulant effects of AF were diminished or absent for FVII-depleted plasma or in the presence of a blocking anti-TF antibody or low-molecular-weight heparin. In a purified system, AF reduced FX activation by the TF/FVIIa complex. The addition of a blocking anti-tissue factor pathway inhibitor (TFPI) antibody reversed the effect of AF on FX activation. Western blotting confirmed the existence of both TF and TFPI in AF. AF enhanced prothrombin activation by FXa. The addition of annexin V, or lactadherin, which bind to PS, or the use of Gla-domainless prothrombin mitigated the effect of AF on prothrombin activation. PS levels in AF and normal plasma were 811±376 and 10.4±3.8 μM, respectively. Conclusions: The procoagulability of AF is independent of the contact pathway while being sensitive to both TF and TFPI levels. Furthermore, PS in AF significantly contributes to its procoagulability. This knowledge is important when developing strategies to lessen the procoagulability of AF without compromising hemostasis in the setting of AF embolism-associated coagulopathy.

Delta-9-tetrahydrocannabinol (THC), the psychoactive component of cannabis, remains a schedule I substance, thus safety data regarding the effects on the cardiovascular and prenatal health are limited. Importantly, there is evidence showing prenatal cannabis exposure can negatively impact fetal organ development, including the cardiovascular system. THC can cross the placenta and bind to cannabinoid receptors expressed in the developing fetus, including on endothelial cells. To understand the impact of prenatal THC exposure on the fetal cardiovascular system, we used our rhesus macaque model of prenatal daily edible THC consumption. Before conception, animals were acclimated to THC (2.5 mg/7 kg/day, equivalent to a heavy medical cannabis dose) and maintained on this dose daily throughout pregnancy. Fetal tissue samples were collected at

Kidneys are among the most structurally complex organs in the body. Their architecture is critical to ensure proper function and is often impacted by diseases such as diabetes and hypertension. Understanding the spatial interplay between the different structures of the nephron and renal vasculature is crucial. Recent efforts have demonstrated the value of three-dimensional (3D) imaging in revealing new insights into the various components of the kidney; however, these studies used antibodies or autofluorescence to detect structures and so were limited in their ability to compare the many subtle structures of the kidney at once. Here, through 3D reconstruction of fetal rhesus macaque kidneys at cellular resolution, we demonstrate the power of deep learning in exhaustively labelling seventeen microstructures of the kidney. Using these tissue maps, we interrogate the spatial distribution and spatial correlation of the glomeruli, renal arteries, and the nephron. This work demonstrates the power of deep learning applied to 3D tissue images to improve our ability to compare many microanatomical structures at once, paving the way for further works investigating renal pathologies.

Background: Platelet activation plays a pivotal role in physiological hemostasis and thrombosis. Protein Kinase C theta (PKCθ) isoforms exert significant regulatory influence on platelet activation. While specific PKC family members have well-defined roles in platelet function, the roles of PKCθ remain less explored. Objectives: To determine mechanisms of PKCθ signaling that orchestrate procoagulant platelet generation. Methods: Platelets were prepared from healthy human donors for ex vivo experiments. Platelet signaling and function were studied following stimulation with GPVI agonist crosslinked collagen-related peptide (CRP-XL). To investigate PKCθ inhibition mechanisms in platelets, small molecule inhibitors targeting the PKCθ (CC-90005 and C20) were employed. Results: From phosphoproteomics, we noted prominent phosphorylation on the C-terminus PKCθ at Ser685. Pretreatment of platelets with inhibitors specific PKC isoforms revealed that PKCα/β, PKCθ, and PKCΔ activities determine PKCθ Ser685 phosphorylation. From the PKC Inhibitors Activity Curves, we noted a robust and selective inhibitory impact of CC-90005 on PKCθ, with specificity surpassing that of C20. Parallel platelet function analyses revealed that inhibiting PKCθ had minimal impact on platelet spreading and aggregation. However, PKCθ inhibition in the presence of Ca 2+ upregulated platelet phosphatidylserine (PS) exposure, as measured by flow cytometry. This was accompanied by an increase in platelet procoagulant activity, where PKCθ inhibition reduced the lag time for fibrin formation. Furthermore, fluorescence microscopy also found that PKCθ inhibition significantly augmented the proportion of procoagulant platelets and microparticles. Additionally, compared to the control group, the use of cyclosporin A (CsA) reduced the production of procoagulant platelets, but the addition of CC-90005 or C20 rescued this phenomenon, with signal intensity surpassing that of the control group. Conclusions: Our study proposes a model wherein PKCΔ and PKCα/β activities induce the phosphorylation of PKCθ at S685, influencing mitochondrial calcium signaling and supporting procoagulant platelet generation.