Abstract The Bacillus cereus group, also known as B. cereus sensu lato ( s.l. ), is a species complex comprising numerous closely related lineages, which vary in their ability to cause illness in humans and animals. The classification of B. cereus s.l. isolates into species-level taxonomic units is essential for facilitating communication between and among microbiologists, clinicians, public health officials, and industry professionals, but is not always straightforward. A recently proposed genomospecies-subspecies-biovar taxonomic framework aims to provide a standardized nomenclature for this species complex but relies heavily on whole-genome sequencing (WGS), a technology with limited accessibility. It thus is unclear whether popular, low-cost typing methods (e.g., single- and multi-locus sequence typing) remain congruent with the proposed taxonomy. Here, we characterize 2,231 B. cereus s.l. genomes using a combination of in silico (i) average-nucleotide identity (ANI)-based genomospecies assignment, (ii) ANI-based subspecies assignment, (iii) seven-gene multi-locus sequence typing (MLST), (iv) panC group assignment, (v) rpoB allelic typing, and (vi) virulence factor detection. We show that sequence types (STs) assigned using MLST can be used for genomospecies assignment, and we provide a comprehensive list of ST/genomospecies associations. For panC group assignment, we show that an adjusted, eight-group framework is largely congruent with the proposed eight-genomospecies taxonomy and resolves incongruencies observed in the historical seven-group framework among isolates assigned to panC Groups II, III, and VI. We additionally provide a list of loci that capture the topology of the whole-genome B. cereus s.l. phylogeny that may be used in future sequence typing efforts. For researchers with access to WGS, MLST, and/or panC data, we showcase how our recently released software, BTyper3 ( https://github.com/lmc297/BTyper3 ), can be used to assign B. cereus s.l. isolates to taxonomic units within this proposed framework with little-to-no user intervention or domain-specific knowledge of B. cereus s.l. taxonomy. We additionally outline a novel method for assigning B. cereus s.l. genomes to pseudo-gene flow units within proposed genomospecies. The results presented here highlight the backwards-compatibility and accessibility of the proposed taxonomic framework and illustrate that WGS is not a necessity for microbiologists who want to use the proposed taxonomy effectively.

The ability to cause foodborne illness, anthrax, and other infections has been attributed to numerous lineages within Bacillus cereus sensu lato ( s.l. ). However, existing pathogen surveillance databases facilitate dangerous pathogen misidentifications when applied to B. cereus s.l. , potentially hindering outbreak or bioterrorism attack response efforts. To address this, we developed BTyperDB ( www.btyper.app ), an atlas of B. cereus s.l. genomes with standardized, community-curated metadata. BTyperDB aggregates all publicly available B. cereus s.l. genomes (including >2,600 previously unassembled genomes) with novel genomes donated by laboratories around the world, nearly doubling the number of publicly available B. cereus s.l. genomes. To showcase its utility for pathogen surveillance, we use BTyperDB to identify emerging anthrax toxin- and capsule-harboring lineages. Overall, our study provides insight into the epidemiology of an under-studied group of emerging pathogens and highlights the benefits of inclusive, community-driven metadata FAIRification efforts.

Abstract Salmonella enterica subspecies enterica serotype Typhimurium definitive type 104 (DT104) can infect both humans and animals and is often multidrug-resistant (MDR). Previous studies have indicated that, unlike most S. Typhimurium, the overwhelming majority of DT104 strains produce pertussis-like toxin ArtAB via prophage-encoded genes artAB . However, DT104 that lack artAB have been described on occasion. Here, we identify a MDR DT104 complex lineage circulating among humans and cattle in the United States, which lacks artAB (i.e., the “U.S. artAB -negative major clade”; n = 42 genomes). Unlike most other bovine- and human-associated DT104 complex strains from the U.S. ( n = 230 total genomes), which harbor artAB on prophage Gifsy-1 ( n = 177), members of the U.S. artAB -negative major clade lack Gifsy-1, as well as anti-inflammatory effector gogB . The U.S. artAB -negative major clade encompasses human- and cattle-associated strains isolated from ≥11 U.S. states over a twenty-year period. The clade was predicted to have lost artAB , Gifsy-1, and gogB circa 1985-1987 (95% highest posterior density interval 1979.0-1992.1). When compared to DT104 genomes from other world regions ( n = 752 total genomes), several additional, sporadic artAB , Gifsy-1, and/or gogB loss events among clades encompassing ≤5 genomes were observed. Using phenotypic assays that simulate conditions encountered during human and/or bovine digestion, members of the U.S. artAB -negative major clade did not differ from closely related Gifsy-1/ artAB / gogB -harboring U.S. DT104 complex strains (ANOVA raw P -value > 0.05); thus, future research is needed to elucidate the roles that artAB , gogB , and Gifsy-1 play in DT104 virulence in humans and animals. Impact Statement Multi-drug resistant (MDR) Salmonella enterica serotype Typhimurium definitive type 104 (DT104) was responsible for a global epidemic among humans and animals throughout the 1990s and continues to circulate worldwide. Previous studies have indicated that the vast majority of DT104 produce pertussis-like toxin ArtAB via prophage-encoded artAB . Here, we identify a DT104 complex lineage that has been circulating among cattle and humans across ≥11 U.S. states for over twenty years, which lacks the ability to produce ArtAB (i.e., the “U.S. artAB -negative major clade”). The common ancestor of all U.S. artAB -negative major clade members lost the ability to produce ArtAB in the 1980s; however, the reason for this loss-of-function event within this well-established pathogen remains unclear. The role that ArtAB plays in DT104 virulence remains elusive, and phenotypic assays conducted here indicate that members of the U.S. artAB -negative major clade do not have a significant advantage or disadvantage relative to closely related, Gifsy-1/ artAB / gogB -harboring U.S. DT104 complex strains when exposed to stressors encountered during human and/or bovine digestion in vitro . However, ArtAB heterogeneity within the DT104 complex suggests clade-specific selection for or against maintenance of ArtAB. Thus, future studies querying the virulence characteristics of the U.S. artAB -negative major clade are needed. Data Summary Supplementary Data is available under DOI 10.5281/zenodo.7688792, with URL https://doi.org/10.5281/zenodo.7688792 .

Abstract Livestock represent a possible reservoir for facilitating the transmission of the zoonotic foodborne pathogen Salmonella enterica to humans; there is also concern that strains can acquire resistance to antimicrobials in the farm environment. Here, we use whole-genome sequencing (WGS) to characterize Salmonella strains ( n = 128) isolated from healthy dairy cattle and their associated environments on 13 New York State farms to assess the diversity and microevolution of this important pathogen at the level of the individual herd. Additionally, the accuracy and concordance of multiple in silico tools are assessed, including: (i) two in silico serotyping tools, (ii) combinations of five antimicrobial resistance (AMR) determinant detection tools and one to five AMR determinant databases, and (iii) one antimicrobial minimum inhibitory concentration (MIC) prediction tool. For the isolates sequenced here, in silico serotyping methods outperformed traditional serotyping and resolved all un-typable and/or ambiguous serotype assignments. Serotypes assigned in silico showed greater congruency with the Salmonella whole-genome phylogeny than traditional serotype assignments, and in silico methods showed high concordance (99% agreement). In silico AMR determinant detection methods additionally showed a high degree of concordance, regardless of the pipeline or database used (≥98% agreement between susceptible/resistant assignments for all pipeline/database combinations). For AMR detection methods that relied exclusively on nucleotide BLAST, accuracy could be maximized by using a range of minimum nucleotide identity and coverage thresholds, with thresholds of 75% nucleotide identity and 50-60% coverage adequate for most pipeline/database combinations. In silico characterization of the microevolution and AMR dynamics of each of six serotype groups ( S. Anatum, Cerro, Kentucky, Meleagridis, Newport, Typhimurium/Typhimurium variant Copenhagen) revealed that some lineages were strongly associated with individual farms, while others were distributed across multiple farms. Numerous AMR determinant acquisition and loss events were identified, including the recent acquisition of cephalosporin resistance-conferring bla CMY - and bla CTX-M -type beta-lactamases. The results presented here provide high-resolution insight into the temporal dynamics of AMR Salmonella at the scale of the individual farm and highlight both the strengths and limitations of WGS in tracking zoonotic pathogens and their associated AMR determinants at the livestock-human interface.