ABSTRACT Background The newest generation of DNA sequencing technology is highlighted by the ability to sequence reads hundreds of kilobases in length, and the increased availability of long read data has democratized the genome sequencing and assembly process. PacBio and Oxford Nanopore Technologies (ONT) have pioneered competitive long read platforms, with more recent work focused on improving sequencing throughput and per-base accuracy. Released in 2019, the PacBio Sequel II platform advertises substantial enhancements over previous PacBio systems. Results We used whole-genome sequencing data produced by two PacBio platforms (Sequel II and RS II) and two ONT protocols (Rapid Sequencing and Ligation Sequencing) to compare assemblies of the bacteria Escherichia coli and the fruit fly Drosophila ananassae . Sequel II assemblies had higher contiguity and consensus accuracy relative to other methods, even after accounting for differences in sequencing throughput. ONT RAPID libraries had the fewest chimeric reads in addition to superior quantification of E. coli plasmids versus ligation-based libraries. The quality of assemblies can be enhanced by adopting hybrid approaches using Illumina libraries for bacterial genome assemblies or combined ONT and Sequel II libraries for eukaryotic genome assemblies. Genome-wide DNA methylation could be detected using both technologies, however ONT libraries enabled the identification of a broader range of known E. coli methyltransferase recognition motifs in addition to undocumented D. ananassae motifs. Conclusions The ideal choice of long read technology may depend on several factors including the question or hypothesis under examination. No single technology outperformed others in all metrics examined.

The Shigella species are Gram-negative, facultative intracellular pathogens that invade the colonic epithelium and cause significant diarrheal disease. Despite extensive research on the pathogen, comprehensive understanding of how Shigella initiates contact with epithelial cells remains unknown. Shigella maintains many of the same Escherichia coli adherence gene operons; however, at least one critical gene component in each operon is currently annotated as a pseudogene in reference genomes. These annotations, coupled with a lack of structures upon microscopic analysis following growth in laboratory media, have led the field to hypothesize that Shigella is unable to produce fimbriae or other “traditional” adherence factors. Nevertheless, our previous analyses have demonstrated that a combination of bile salts and glucose induce both biofilm formation and adherence to colonic epithelial cells. Through a two-part investigation, we first utilized various transcriptomic analyses to demonstrate that S. flexneri strain 2457T adherence gene operons are transcribed. Subsequently, we performed mutation, electron microscopy, biofilm, infection, and proteomic analyses to characterize three of the structural genes. In combination, these studies demonstrate that despite the gene annotations, S. flexneri 2457T uses adherence factors to initiate biofilm formation as well as epithelial cell contact. Furthermore, host factors, namely glucose and bile salts in the small intestine, offer key environmental stimuli required for proper adherence factor expression in S. flexneri. This research may have a significant impact on vaccine development for Shigella and further highlights the importance of utilizing in vivo-like conditions to study bacterial pathogenesis.

The stability of the Escherichia coli populations in the human gastrointestinal tract are not fully appreciated, and represent a significant knowledge gap regarding gastrointestinal community structure, as well as resistance to incoming pathogenic bacterial species and antibiotic treatment. The current study examines the genomic content of 240 Escherichia coli isolates from children 2 to 35 months old in Tanzania. The E. coli strains were isolated from three time points spanning a six month time period, with or without antibiotic treatment. The resulting isolates were sequenced, and the genomes compared. The findings in this study highlight the transient nature of E. coli strains in the gastrointestinal tract of children, as during a six-month interval, no one individual contained phylogenomically related isolates at all three time points. While the majority of the isolates at any one time point were phylogenomically similar, most individuals did not contain phylogenomically similar isolates at more than two time points. Examination of global genome content, canonical E. coli virulence factors, multilocus sequence type, serotype, and antimicrobial resistance genes identified diversity even among phylogenomically similar strains. There was no apparent increase in the antimicrobial resistance gene content after antibiotic treatment. The examination of the E. coli from longitudinal samples from multiple children in Tanzania provides insight into the genomic diversity and population variability of resident E. coli within the rapidly changing environment of the gastrointestinal tract.

As sequencing read length has increased, researchers have quickly adopted longer reads for their experiments. Here, we examine host-pathogen interaction studies to assess if using longer reads is warranted. Six diverse datasets encountered in studies of host-pathogen interactions were used to assess what genomic attributes might affect the outcome of differential gene expression analysis including: gene density, operons, gene length, number of introns/exons, and intron length. Principal components analysis, hierarchical clustering with bootstrap support, and regression analyses of pairwise comparisons were undertaken on the same reads, looking at all combinations of paired and unpaired reads trimmed to 36, 54, 72, and 101-bp. For E. coli, 36-bp single end reads performed as well as any other read length and as well as paired end reads. For all other comparisons, 54-bp and 72-bp reads were typically equivalent and different from 36-bp and 101-bp reads. Read pairing improved the outcome in several, but not all, comparisons in no discernable pattern, such that using paired reads is recommended in most scenarios. No specific genome attribute appeared to influence the data. However, experiments with an a priori expected greater biological complexity had more variable results with all read lengths relative to those with decreased complexity. When combined with cost, 54-bp paired end reads provided the most robust, internally reproducible results across all comparisons. However, using 36-bp single end reads may be desirable for bacterial samples, although possibly only if the transcriptional response is expected a priori to be robust.

Enrichment methodologies enable analysis of minor members in multi-species transcriptomic analyses. We compared standard enrichment of bacterial and eukaryotic mRNA to targeted enrichment with Agilent SureSelect (AgSS) capture for Brugia malayi, Aspergillus fumigatus, and the Wolbachia endosymbiont of B. malayi (wBm). Without introducing significant systematic bias, the AgSS quantitatively enriched samples, resulting in more reads mapping to the target organism. The AgSS-enriched libraries consistently had a positive linear correlation with its unenriched counterpart (r2=0.559-0.867). Up to a 2,242-fold enrichment of RNA from the target organism was obtained following a power law (r2=0.90), with the greatest fold enrichment achieved in samples with the largest ratio difference between the major and minor members. While using a single total library for prokaryote and eukaryote in a single sample could be beneficial for samples where RNA is limiting, we observed a decrease in reads mapping to protein coding genes and an increase of multi-mapping reads to rRNAs in AgSS enrichments from eukaryotic total RNA libraries as opposed to eukaryotic poly(A)-enriched libraries. Our results support a recommendation of using Agilent SureSelect targeted enrichment on poly(A)-enriched libraries for eukaryotic captures and total RNA libraries for prokaryotic captures to increase the robustness of multi-species transcriptomic studies.

Pseudomonas aeruginosa (Pa) and Burkholderia cepacia complex (Bcc) species are opportunistic lung pathogens of individuals with cystic fibrosis (CF). While Pa can initiate long-term infections in younger CF patients, Bcc infections only arise in teenagers and adults. Both Pa and Bcc use type VI secretion systems (T6SS) to mediate interbacterial competition. Here, we show that Pa isolates from teenage/adult CF patients, but not those from young CF patients, are outcompeted by the epidemic Bcc isolate Burkholderia cenocepacia strain AU1054 (BcAU1054) in a T6SS-dependent manner. The genomes of susceptible Pa isolates harbor T6SS-abrogating mutations, the repair of which, in some cases, rendered the isolates resistant. Moreover, seven of eight Bcc strains outcompeted Pa strains isolated from the same patients. Our findings suggest that certain mutations that arise as Pa adapts to the CF lung abrogate T6SS activity, making Pa and its human host susceptible to potentially fatal Bcc superinfection.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.