Metabolomics studies hold promise for the discovery of pathways linked to disease processes. Cardiovascular disease (CVD) represents the leading cause of death and morbidity worldwide. Here we used a metabolomics approach to generate unbiased small-molecule metabolic profiles in plasma that predict risk for CVD. Three metabolites of the dietary lipid phosphatidylcholine—choline, trimethylamine N-oxide (TMAO) and betaine—were identified and then shown to predict risk for CVD in an independent large clinical cohort. Dietary supplementation of mice with choline, TMAO or betaine promoted upregulation of multiple macrophage scavenger receptors linked to atherosclerosis, and supplementation with choline or TMAO promoted atherosclerosis. Studies using germ-free mice confirmed a critical role for dietary choline and gut flora in TMAO production, augmented macrophage cholesterol accumulation and foam cell formation. Suppression of intestinal microflora in atherosclerosis-prone mice inhibited dietary-choline-enhanced atherosclerosis. Genetic variations controlling expression of flavin monooxygenases, an enzymatic source of TMAO, segregated with atherosclerosis in hyperlipidaemic mice. Discovery of a relationship between gut-flora-dependent metabolism of dietary phosphatidylcholine and CVD pathogenesis provides opportunities for the development of new diagnostic tests and therapeutic approaches for atherosclerotic heart disease. Stanley Hazen and colleagues show that gut flora can influence cardiovascular disease by metabolizing a dietary phospholipid. A targeted metabolomics approach was used to identify plasma metabolites whose levels predict future risk for experiencing a non-fatal heart attack, stroke or death in subjects undergoing cardiac evaluation. Plasma levels of three metabolites of dietary phosphatidylcholine — choline, betaine and trimethylamine N-oxide (TMAO) — are associated with increased risk of cardiovascular disease. The gut flora is known to have a role in TMAO formation from choline. In addition, experiments in atherosclerosis-prone mice show that dietary choline enhances macrophage foam-cell formation and lesion formation — but not if the gut flora is depleted with antibiotics. This work suggests new diagnostic and therapeutic approaches for atherosclerotic heart disease. This paper shows that gut flora can influence cardiovascular disease, by metabolizing a dietary phospholipid. Using a metabolomics approach it is found that plasma levels of three metabolites of dietary phosphatidylcholine—choline, betaine and TMAO—are associated with increased risk of cardiovascular disease in humans. The gut flora is known to have a role in TMAO formation from choline, and this paper shows that dietary choline supplementation enhances macrophage foam cell formation and lesion formation in atherosclerosis-prone mice, but not if the gut flora are depleted with antibiotics.

The goal of the Complex Trait Consortium is to promote the development of resources that can be used to understand, treat and ultimately prevent pervasive human diseases. Existing and proposed mouse resources that are optimized to study the actions of isolated genetic loci on a fixed background are less effective for studying intact polygenic networks and interactions among genes, environments, pathogens and other factors. The Collaborative Cross will provide a common reference panel specifically designed for the integrative analysis of complex systems and will change the way we approach human health and disease.

Circulating trimethylamine-N-oxide (TMAO) levels are strongly associated with atherosclerosis. We now examine genetic, dietary, and hormonal factors regulating TMAO levels. We demonstrate that two flavin mono-oxygenase family members, FMO1 and FMO3, oxidize trimethylamine (TMA), derived from gut flora metabolism of choline, to TMAO. Further, we show that FMO3 exhibits 10-fold higher specific activity than FMO1. FMO3 overexpression in mice significantly increases plasma TMAO levels while silencing FMO3 decreases TMAO levels. In both humans and mice, hepatic FMO3 expression is reduced in males compared to females. In mice, this reduction in FMO3 expression is due primarily to downregulation by androgens. FMO3 expression is induced by dietary bile acids by a mechanism that involves the farnesoid X receptor (FXR), a bile acid-activated nuclear receptor. Analysis of natural genetic variation among inbred strains of mice indicates that FMO3 and TMAO are significantly correlated, and TMAO levels explain 11% of the variation in atherosclerosis.

Leukotrienes are inflammatory mediators generated from arachidonic acid (polyunsaturated n–6 fatty acid) by the enzyme 5-lipoxygenase. Since atherosclerosis involves arterial inflammation, we hypothesized that a polymorphism in the 5-lipoxygenase gene promoter could relate to atherosclerosis in humans and that this effect could interact with the dietary intake of competing 5-lipoxygenase substrates.

Epigenetic biomarkers of aging (the "epigenetic clock") have the potential to address puzzling findings surrounding mortality rates and incidence of cardio-metabolic disease such as: (1) women consistently exhibiting lower mortality than men despite having higher levels of morbidity; (2) racial/ethnic groups having different mortality rates even after adjusting for socioeconomic differences; (3) the black/white mortality cross-over effect in late adulthood; and (4) Hispanics in the United States having a longer life expectancy than Caucasians despite having a higher burden of traditional cardio-metabolic risk factors.We analyzed blood, saliva, and brain samples from seven different racial/ethnic groups. We assessed the intrinsic epigenetic age acceleration of blood (independent of blood cell counts) and the extrinsic epigenetic aging rates of blood (dependent on blood cell counts and tracks the age of the immune system). In blood, Hispanics and Tsimane Amerindians have lower intrinsic but higher extrinsic epigenetic aging rates than Caucasians. African-Americans have lower extrinsic epigenetic aging rates than Caucasians and Hispanics but no differences were found for the intrinsic measure. Men have higher epigenetic aging rates than women in blood, saliva, and brain tissue.Epigenetic aging rates are significantly associated with sex, race/ethnicity, and to a lesser extent with CHD risk factors, but not with incident CHD outcomes. These results may help elucidate lower than expected mortality rates observed in Hispanics, older African-Americans, and women.

Myocardial infarction (MI), a leading cause of death around the world, displays a complex pattern of inheritance. When MI occurs early in life, genetic inheritance is a major component to risk. Previously, rare mutations in low-density lipoprotein (LDL) genes have been shown to contribute to MI risk in individual families, whereas common variants at more than 45 loci have been associated with MI risk in the population. Here we evaluate how rare mutations contribute to early-onset MI risk in the population. We sequenced the protein-coding regions of 9,793 genomes from patients with MI at an early age (≤50 years in males and ≤60 years in females) along with MI-free controls. We identified two genes in which rare coding-sequence mutations were more frequent in MI cases versus controls at exome-wide significance. At low-density lipoprotein receptor (LDLR), carriers of rare non-synonymous mutations were at 4.2-fold increased risk for MI; carriers of null alleles at LDLR were at even higher risk (13-fold difference). Approximately 2% of early MI cases harbour a rare, damaging mutation in LDLR; this estimate is similar to one made more than 40 years ago using an analysis of total cholesterol. Among controls, about 1 in 217 carried an LDLR coding-sequence mutation and had plasma LDL cholesterol > 190 mg dl(-1). At apolipoprotein A-V (APOA5), carriers of rare non-synonymous mutations were at 2.2-fold increased risk for MI. When compared with non-carriers, LDLR mutation carriers had higher plasma LDL cholesterol, whereas APOA5 mutation carriers had higher plasma triglycerides. Recent evidence has connected MI risk with coding-sequence mutations at two genes functionally related to APOA5, namely lipoprotein lipase and apolipoprotein C-III (refs 18, 19). Combined, these observations suggest that, as well as LDL cholesterol, disordered metabolism of triglyceride-rich lipoproteins contributes to MI risk.

Summary

Background

 We tested whether genetic factors distinctly contribute to either development of coronary atherosclerosis or, specifically, to myocardial infarction in existing coronary atherosclerosis. 

Methods

 We did two genome-wide association studies (GWAS) with coronary angiographic phenotyping in participants of European ancestry. To identify loci that predispose to angiographic coronary artery disease (CAD), we compared individuals who had this disorder (n=12 393) with those who did not (controls, n=7383). To identify loci that predispose to myocardial infarction, we compared patients who had angiographic CAD and myocardial infarction (n=5783) with those who had angiographic CAD but no myocardial infarction (n=3644). 

Findings

 In the comparison of patients with angiographic CAD versus controls, we identified a novel locus, ADAMTS7 (p=4·98×10⁻¹³). In the comparison of patients with angiographic CAD who had myocardial infarction versus those with angiographic CAD but no myocardial infarction, we identified a novel association at the ABO locus (p=7·62×10⁻⁹). The ABO association was attributable to the glycotransferase-deficient enzyme that encodes the ABO blood group O phenotype previously proposed to protect against myocardial infarction. 

Interpretation

 Our findings indicate that specific genetic predispositions promote the development of coronary atherosclerosis whereas others lead to myocardial infarction in the presence of coronary atherosclerosis. The relation to specific CAD phenotypes might modify how novel loci are applied in personalised risk assessment and used in the development of novel therapies for CAD. 

Funding

 The PennCath and MedStar studies were supported by the Cardiovascular Institute of the University of Pennsylvania, by the MedStar Health Research Institute at Washington Hospital Center and by a research grant from GlaxoSmithKline. The funding and support for the other cohorts contributing to the paper are described in the webappendix.

We previously reported the identification of a locus on mouse chromosome 6 that confers almost total resistance to atherogenesis, even on a hypercholesterolemic (LDL receptor-null) background. 5-Lipoxygenase (5-LO) is the rate-limiting enzyme in leukotriene synthesis and was among the chromosome 6 locus candidate genes that we examined. The levels of 5-LO mRNA were reduced about 5-fold in a congenic strain, designated CON6, containing the resistant chromosome 6 region derived from the CAST/Ei strain (CAST), as compared with the background C57BL/6J (B6) strain. 5-LO protein levels were similarly reduced in the CON6 mice. Sequencing of the 5-LO cDNA revealed several differences between CON6 and the B6 strain. To test the whether 5-LO is responsible for the resistant phenotype, we bred a 5-LO knockout allele onto an LDL receptor-null (LDLR(-/-)) background. On this background, the mice bred poorly and only heterozygous 5-LO knockout mice were obtained. These mice showed a dramatic decrease (>26-fold; P<0.0005) in aortic lesion development, similar to the CON6 mice. Immunohistochemistry revealed that 5-LO was abundantly expressed in atherosclerotic lesions of apoE(-/-) and LDLR(-/-) deficient mice, appearing to colocalize with a subset of macrophages but not with all macrophage-staining regions. When bone marrow from 5-LO(+/-) mice was transplanted into LDLR(-/-), there was a significant reduction in atherogenesis, suggesting that macrophage 5-LO is responsible, at least in part, for the effect on atherosclerosis. These results indicate that 5-LO contributes importantly to the atherogenic process and they provide strong presumptive evidence that reduced 5-LO expression is partly responsible for the resistance to atherosclerosis in CON6 mice.

Background: Periconceptional folate is essential for proper neurodevelopment. Objective: Maternal folic acid intake was examined in relation to the risk of autism spectrum disorder (ASD) and developmental delay (DD). Design: Families enrolled in the CHARGE (CHildhood Autism Risks from Genetics and Environment) Study from 2003 to 2009 were included if their child had a diagnosis of ASD (n = 429), DD (n = 130), or typical development (TD; n = 278) confirmed at the University of California Davis Medical Investigation of Neurodevelopmental Disorders Institute by using standardized clinical assessments. Average daily folic acid was quantified for each mother on the basis of dose, brands, and intake frequency of vitamins, supplements, and breakfast cereals reported through structured telephone interviews. Results: Mean (±SEM) folic acid intake was significantly greater for mothers of TD children than for mothers of children with ASD in the first month of pregnancy (P1; 779.0 ± 36.1 and 655.0 ± 28.7 μg, respectively; P < 0.01). A mean daily folic acid intake of ≥600 μg (compared with <600 μg) during P1 was associated with reduced ASD risk (adjusted OR: 0.62; 95% CI: 0.42, 0.92; P = 0.02), and risk estimates decreased with increased folic acid (P-trend = 0.001). The association between folic acid and reduced ASD risk was strongest for mothers and children with MTHFR 677 C>T variant genotypes. A trend toward an association between lower maternal folic acid intake during the 3 mo before pregnancy and DD was observed, but not after adjustment for confounders. Conclusions: Periconceptional folic acid may reduce ASD risk in those with inefficient folate metabolism. The replication of these findings and investigations of mechanisms involved are warranted.

Anaemia is a chief determinant of global ill health, contributing to cognitive impairment, growth retardation and impaired physical capacity. To understand further the genetic factors influencing red blood cells, we carried out a genome-wide association study of haemoglobin concentration and related parameters in up to 135,367 individuals. Here we identify 75 independent genetic loci associated with one or more red blood cell phenotypes at P < 10−8, which together explain 4–9% of the phenotypic variance per trait. Using expression quantitative trait loci and bioinformatic strategies, we identify 121 candidate genes enriched in functions relevant to red blood cell biology. The candidate genes are expressed preferentially in red blood cell precursors, and 43 have haematopoietic phenotypes in Mus musculus or Drosophila melanogaster. Through open-chromatin and coding-variant analyses we identify potential causal genetic variants at 41 loci. Our findings provide extensive new insights into genetic mechanisms and biological pathways controlling red blood cell formation and function. A series of genetic studies have led to the discovery of novel independent loci and candidate genes associated with red blood cell phenotype; for a proportion of these genes potential single-nucleotide genetic variants are also identified, providing new insights into genetic pathways controlling red blood cell formation, function and pathology. This genome-wide association study of more than 135,000 individuals identifies 75 independent genetic loci influencing red blood cell phenotypes, enriched for genes involved in cell cycle control, transcriptional regulation, growth factor and cytokine signalling, haemoglobin synthesis, iron handling and cytoskeletal function, as well as a number of genes of uncertain or unknown function. Further analyses identified 121 candidate genes related to red blood cell biology, one-third of which have haematopoietic phenotypes in mouse and Drosophila.