Abstract Eliciting broadly neutralizing antibodies (bNAbs) against the four dengue virus serotypes (DENV1-4) that are spreading into new territories is an important goal of vaccine design. To delineate bNAb targets, we characterized 28 monoclonal antibodies belonging to expanded and hypermutated clonal families identified by transcriptomic analysis of single plasmablasts from DENV-infected individuals. Among these, we identified two somatically related bNAbs that potently neutralized DENV1-4. Mutagenesis studies revealed that the major recognition determinants of these bNAbs are in E protein domain I, distinct from the only known class of human bNAbs against flaviviruses with a well-defined epitope. B cell repertoire analysis from acute-phase peripheral blood suggested a memory origin and divergent somatic hypermutation pathways for these bNAbs, and a limited number of mutations was sufficient for neutralizing activity. Our study suggests multiple B cell evolutionary pathways leading to DENV bNAbs targeting a novel epitope that can be exploited for vaccine design.

We describe an adaptation of conventional ELISA methods to an ELISA-Array format using non-contact Piezo printing of up to 30 spots of purified recombinant viral fusion proteins, vaccine and virus on 96 well high-protein binding plates. Antigens were printed in 1 nanoliter volumes of protein stabilizing buffer using as little as 0.25 nanograms of protein, 2000-fold less than conventional ELISA. The performance of the ELISA-Array was demonstrated by serially diluting n=8 human post-flu vaccination plasma samples starting at a 1/1000 dilution and measuring binding to the array of Influenza antigens. Plasma polyclonal antibody levels were detected using a cocktail of biotinylated anti-human kappa and lambda light chain antibodies, followed by a Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate and the dose-dependent signal was developed with a precipitable TMB substrate. Intra- and inter-assay precision of absorbance units among the eight donor samples showed mean CVs of 4.8% and 10.8%, respectively. The plasma could be differentiated by donor and antigen with titer sensitivities ranging from 1 × 103 to 4 × 106, IC50 values from 1 × 104 to 9 × 106, and monoclonal antibody sensitivities in the ng/mL range. Equivalent sensitivities of ELISA versus ELISA-Array, compared using plasma and an H1N1 HA trimer, were achieved on the ELISA-Array printed at 0.25ng per 200um spot and 1000ng per ELISA 96-well. Vacuum-sealed array plates were shown to be stable when stored for at least 2 days at ambient temperature and up to 1 month at 4-8°C. By the use of any set of printed antigens and analyte matrices the methods of this multiplexed ELISA-Array format can be broadly applied in translational research.