The calcium-calmodulin–dependent kinase II (CaMKII) is required for hippocampal long-term potentiation (LTP) and spatial learning. In addition to its calcium-calmodulin (CaM)–dependent activity, CaMKII can undergo autophosphorylation, resulting in CaM-independent activity. A point mutation was introduced into the αCaMKII gene that blocked the autophosphorylation of threonine at position 286 (Thr 286 ) of this kinase without affecting its CaM-dependent activity. The mutant mice had no N -methyl- d -aspartate receptor–dependent LTP in the hippocampal CA1 area and showed no spatial learning in the Morris water maze. Thus, the autophosphorylation of αCaMKII at Thr 286 appears to be required for LTP and learning.

Cloning and sequencing of cDNAs isolated from a rat cortex cDNA library reveals that a gene family encodes several highly homologous K+ channel forming (RCK) proteins. Functional characterization of the channels expressed in Xenopus laevis oocytes following microinjection of in vitro transcribed RCK-specific RNAs shows that each of the RCK proteins forms K+ channels that differ greatly in both their functional and pharmacological properties. This suggests that the molecular basis for the diversity of voltage-gated K+ channels in mammalian brain is based, at least partly, on the expression of several RCK proteins by a family of genes and their assembly to homooligomeric K+ channels with different functional properties.

Abstract

 We have used homologous recombination in embryonic stem cells to generate mice carrying a mutation in the gene encoding P₀, an immunoglobulin-related recognition molecule and the major protein of peripheral nervous system myelin. These mice are deficient in normal motor coordination and exhibit tremors and occasional convulsions. Axons in their peripheral nerves are severely hypomyelinated and a subset of myelin-like figures and axons degenerate. The mutation leads to an abnormal regulation of some, but not all, molecules involved in myelination. These results demonstrate that P₀ is essential for the normal spiraling, compaction, and maintenance of the peripheral myelin sheath and the continued integrity of associated axons. They further suggest that this protein conveys a signal that regulates Schwann cell gene expression.

Mouse mutants derived by targeted mutagenesis in embryonic stem (ES) cells offer many advantages to the study of the molecular and cellular mechanisms underlying behaviors such as learning and memory, circadian rhythms, motor coordination, and aggression, as well as other neuroscience research areas such as brain development. The beginning of any new field, however, is often marked by a period in which key issues are debated, and as a consequence the approach is sharpened and focused. Theoretical and practical issues related to the impact of genetic background on the analysis of mutant mice have been a central topic of discussion in this new field (4Crawley J.N. Unusual behavioral phenotypes of inbred mouse strains.Trends Neurosci. 1996; 19: 181-182Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (123) Google ScholarCrawley, 1996, 1997; 6Crusio W.E. Gene-targeting studies new methods, old problems.Trends Neurosci. 1996; 19: 186-187Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (95) Google Scholar, 9Gerlai R. Gene targeting studies of mammalian behavior is it the mutation or the background genotype?.Trends Neurosci. 1996; 19: 177-180Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (790) Google Scholar, 12Lathe R. Mice, gene targeting and behaviour more than just genetic background.Trends Neurosci. 1996; 19: 183-185Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (136) Google Scholar, 25Wehner J.M. Silva A. Importance of strain differences in evaluations of learning and memory processes in null mutants.Ment. Retard. Dev. Disabilities Res. Rev. 1996; 2: 243-248Crossref Google Scholar). Analysis of the literature reveals that there is no consensus on the nature of appropriate controls for genetic background. This report summarizes a recent Banbury workshop held in Cold Spring Harbor, New York, on December 8–11, 1996, to discuss these issues in an effort to come to a consensus within the field. The recommendations that follow reflect the need for rigorously controlling the genetic background of experimental animals, and the practical issues surrounding the implementation of the appropriate controls. Three principles emerged from our meeting. First, all reports of genetic experiments must include a detailed description of the genetic background of the animals studied. This description should be exact and include enough detail to allow rederivation of the mice used. Second, the genetic background chosen should not be so complex as to preclude others from reproducing and expanding the experiments reported. Third, use of a common genetic background would facilitate the comparison of results across experiments and among laboratories. For a variety of reasons described below, we recommend that mutations be maintained in congenic lines, and that mutants be analyzed in a defined hybrid (and preferably F1) genetic background. The complexity of biological interactions among genes and proteins is at the heart of issues concerning the importance of genetic background. For example, in defining the impact of the mutation of a protein kinase, it is important to consider the levels of second messengers that activate it, the activities of opposing phosphatases, the availability of substrates, and the general state of the cellular processes that it regulates, which could also be controlled in parallel by many other kinases (17Pawson T. Protein modules and signalling networks.Nature. 1995; 16: 573-580Crossref Scopus (2182) Google Scholar). These and other factors are part of the genetic background in which the mutation is studied. Mutations can have very different phenotypes in different backgrounds (e.g.,1Abeliovich A. Paylor R. Chen C. Kim J.J. Wehner J.M. Tonegawa S. PKC gamma mutant mice exhibit mild deficits in spatial and contextual learning.Cell. 1993; 75: 1263-1271Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (406) Google Scholar, 20Smithies O. Maeda N. Gene targeting approaches to complex genetic diseases atherosclerosis and essential hypertension.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92: 5266-5272Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar, 22Threadgill D.W. Dlugosz A.A. Hansen L.A. Tennenbaum T. Lichti U. Yee D. LaMantia C. Mourton T. Herrup K. Harris R.C. et al.Targeted disruption of mouse EGF receptor effect of genetic background on mutant phenotype.Science. 1995; 269: 230-234Crossref PubMed Scopus (1216) Google Scholar). Because the identity of the genetic elements governing these other factors (modifiers) is usually unknown, it is important to keep them constant when evaluating the impact of a mutation. Only if the same genetic background is used across experiments can differences between the phenotypes obtained be ascribed to the mutations rather than to different genetic backgrounds. Adoption of a common genetic background does not preclude comparison of the effects of a given mutation in different backgrounds. Genetic background can be used as a tool in the analysis of a mutation (e.g., quantitative trait loci analysis and enhancer/suppressor screens; 21Takahashi J.S. Pinto L.H. Vitaterna M.H. Forward and reverse genetic approaches to behavior in the mouse.Science. 1994; 264: 1724-1733Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). By placing the same mutation in different genetic backgrounds, it is possible to study facets of gene function that would elude studies in any single background. Additionally, powerful new mapping and cloning strategies may allow the identification of modifiers from different backgrounds (7Dietrich W.F. Lander E.S. Smith J.S. Moser A.R. Gould K.A. Luongo C. Borenstein N. Dove W. Genetic identification of Mom-1, a major modifier locus affecting Min-induced intestinal neoplasia in the mouse.Cell. 1993; 75: 631-639Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (597) Google Scholar, 10Gould K.A. Dietrich W.F. Borenstein N. Lander E.S. Dove W.F. Mom1 is a semi-dominant modifier of intestinal adenoma size and multiplicity in Min/+ mice.Genetics. 1996; 144: 1769-1776Crossref PubMed Google Scholar). Genetic interactions between a mutation and the genetic background may account for the variable penetrance of human genetic diseases, and it is important to study and understand the nature of these interactions. Most targeting experiments to date have relied on the use of ES cells derived from substrain 129 mice. However, the 129 substrains are a complex collection of various backgrounds, and so ES cells derived from them are likewise genetically complex (19Simpson E.M. Linder C.C. Sargent E.E. Davisson M.T. Mobraaten L.E. Sharp J.J. Genetic variation among 129 substrains and its importance for “targeted mutagenesis” in mice.Nat. Genet. 1997; 16: 19-27Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). In addition, recent analysis revealed that some commonly used ES cell lines are polymorphic at a number of loci, showing that they were not derived from inbred strains (19Simpson E.M. Linder C.C. Sargent E.E. Davisson M.T. Mobraaten L.E. Sharp J.J. Genetic variation among 129 substrains and its importance for “targeted mutagenesis” in mice.Nat. Genet. 1997; 16: 19-27Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). This raises the possibility that random segregation of these polymorphic loci to either mutants or controls could affect the phenotypes of the resulting animals and complicate the interpretation of experiments. Nevertheless, it is still possible to use the 129 ES cell lines currently available without compromising experiments, because congenic mutant lines can be generated by backcrossing to standard inbred mice. The extent of backcrossing required will depend on the degree of polymorphism. Genetic markers can be used to accelerate this process (see below). It is important to note that there are ES cell lines derived from inbred 129 substrains (19Simpson E.M. Linder C.C. Sargent E.E. Davisson M.T. Mobraaten L.E. Sharp J.J. Genetic variation among 129 substrains and its importance for “targeted mutagenesis” in mice.Nat. Genet. 1997; 16: 19-27Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Although there are ES cell lines from inbred 129 substrains, the mouse community in general, and neuroscientists specifically, would benefit greatly from the availability of a selection of ES cells from other inbred mouse strains, which would simplify the design of experiments and facilitate the reproduction, continuation, and cross-referencing of genetic studies. However, developing robust ES cells that are pluripotent and do well under extended culture conditions will require the focused attention of expert laboratories. The development of this resource is so important that national and international funding organizations must be encouraged to direct research support to this area. Newly derived ES cell lines could then be made generally available to the community. There are many different ways to make errors in the maintenance of mutant lines, most of which stem from violations of two principles mentioned in the introduction: the exact genetic background of a mutation should always be known, and it should be easily reproducible. Maintaining a mutant line by inbreeding homozygous mice (Figure 1) should be avoided as it violates both principles. Over consecutive generations, random segregation events lead to progressive changes in the genotype of these hybrid lines. During this time, any deleterious aspect of the homozygous targeted mutation may result in selection for background genes that change the mutant phenotype. After 20 generations of brother–sister matings, a new inbred line is generated. Such new inbred strains, even in the absence of a targeted mutation, often contain deleterious allele combinations, resulting in deficits such as reproductive suppression. Additionally, there is no appropriate control for the mutant mice because the exact genotypes are not known at all of the polymorphic alleles randomly segregating during the propagation of such a line (Figure 1). Simply generating a similar line with wild-type (WT) littermates of the mutants is not an adequate solution because of random segregation and fixation of alleles, and because the starting mice differ at the genes linked to the targeted locus. Mutations currently maintained in this manner could be readily transferred to standard inbred backgrounds, with the aid of speed congenics (11Lander E.S. Schork N.J. Genetic Dissection of Complex Traits.Science. 1994; 265: 2037-2048Crossref PubMed Scopus (2678) Google Scholar). Figure 2 depicts a breeding strategy designed to address the problems mentioned above. In brief, we recommend that targeted mutations be maintained as congenic lines. This is accomplished by consistently backcrossing onto defined inbred backgrounds. Inbred strains are homozygous at the vast majority of loci, eliminating variability that may confound the mutant phenotype. Continuous backcrossing reduces the chance of genetic drift and the size of the “differential segment” (see below).Figure 3F2 Hybrids Have Value for Initial Studies and Differential Segment AnalysisShow full captionF2 animals offer the earliest opportunity to examine a new mutant allele homozygous on a 50:50 hybrid background. By mating germ line chimeras derived from a 129 ES cell line (substantively white chromosomes) to C57BL/6 animals (black chromosomes), an F1 generation of genetically identical hybrid heterozygotes is produced. Depending on the nature of the targeted allele (M), these animals may be suitable for study. Intercrossing the F1 heterozygotes will generate the first homozygotes for the targeted allele (upper box). Such F2 animals have a variable, but on average, 50:50 hybrid background. However, the WT littermates of the homozygous mutants may not be ideal controls because the region around the targeted locus differs between WT and homozygous mutant littermates (differential segment). In homozygotes, the differential region is derived from the ES cell genetic background, while in WT mice, it is not. More appropriate WT controls may be prepared by mating the F1 mice not carrying the targeted mutation. To identify the appropriate control animals (lower box), a polymorphic probe (P) must be used to tag the 129 WT genomic region corresponding to the targeted allele. This strategy for differential segment analysis of F2 mice is not restricted to initial analysis but can be employed at any time a targeted mutation is maintained on its original genetic background.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) F2 animals offer the earliest opportunity to examine a new mutant allele homozygous on a 50:50 hybrid background. By mating germ line chimeras derived from a 129 ES cell line (substantively white chromosomes) to C57BL/6 animals (black chromosomes), an F1 generation of genetically identical hybrid heterozygotes is produced. Depending on the nature of the targeted allele (M), these animals may be suitable for study. Intercrossing the F1 heterozygotes will generate the first homozygotes for the targeted allele (upper box). Such F2 animals have a variable, but on average, 50:50 hybrid background. However, the WT littermates of the homozygous mutants may not be ideal controls because the region around the targeted locus differs between WT and homozygous mutant littermates (differential segment). In homozygotes, the differential region is derived from the ES cell genetic background, while in WT mice, it is not. More appropriate WT controls may be prepared by mating the F1 mice not carrying the targeted mutation. To identify the appropriate control animals (lower box), a polymorphic probe (P) must be used to tag the 129 WT genomic region corresponding to the targeted allele. This strategy for differential segment analysis of F2 mice is not restricted to initial analysis but can be employed at any time a targeted mutation is maintained on its original genetic background. However, because of random allele fixation during derivation, these lines can also be homozygous for certain alleles that cause phenotypic abnormalities, such as loss of spatial learning, resistance to kainic acid injury, high seizure susceptibility, etc. (15Müller U. Cristina N. Li Z.-W. Wolfer D.P. Lipp H.-P. Rölicke T. Brandner S. Aguzzi A. Weissmann C. Behavioral and anatomical deficits in mice homozygous for a modified β-amyloid precursor protein (βAPP) gene.Cell. 1994; 79: 755-765Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (273) Google Scholar, 4Crawley J.N. Unusual behavioral phenotypes of inbred mouse strains.Trends Neurosci. 1996; 19: 181-182Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (123) Google Scholar, 25Wehner J.M. Silva A. Importance of strain differences in evaluations of learning and memory processes in null mutants.Ment. Retard. Dev. Disabilities Res. Rev. 1996; 2: 243-248Crossref Google Scholar, 5Crawley J.N. Belknap J.K. Collins A. Crabbe J.C. Frankel W. Henderson N. Hitzemann R.J. Maxson S.C. Miner L.L. Silva A.J. Wehner J.M. Wynshaw-Boris A. Paylor R. Behavioral phenotypes of inbred mouse strains.Psychopharmacology. 1997; in pressGoogle Scholar). Thus, it is often impossible, however, to study certain phenotypes in inbred genetic backgrounds because the parental strain is already affected. For example, most 129 and DBA strains show poor hippocampal-dependent learning (24Upchurch M. Wehner J.M. Differences between inbred strains of mice in Morris water maze performance.Behav. Genet. 1988; 18: 55-68Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar, 27Wolfer D.P. Stagliar-Bozizevic M. Müller U. Lipp H.-P. Assessing the effects of the 129Sv genetic background on swimming navigation learning in transgenic mutants a study using mice with a modified b-amyloid precursor gene.Brain Res. 1997; in pressGoogle Scholar); BALB/c and C3H have visual problems (24Upchurch M. Wehner J.M. Differences between inbred strains of mice in Morris water maze performance.Behav. Genet. 1988; 18: 55-68Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar); and C57BL/6 mice become deaf to certain frequencies at an early age (26Willott J.F. Effects of aging, hearing loss, and anatomical location on thresholds of inferior colliculus neurons in C57BL/6 and CBA mice.J. Neurophysiol. 1986; 56: 391-408PubMed Google Scholar) and are poor avoidance learners (18Schwegler H. Lipp H.-P. Hereditary covariations of neuronal circuitry and behavior correlations between the proportions of hippocampal synaptic fields in the regio inferior and two-way avoidance in mice and rats.Behav. Brain Res. 1983; 7: 1-39Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar). Inbred lines also tend to be very sensitive to environmental stressors, which can often result in considerable within-subjects variability (8Falconer D.S. MacKay T.F.C. Introduction to Quantitative Genetics, IV Edition. Longman, Essex, UK1996Google Scholar). In addition, any single genetic background can either overshadow or exacerbate a specific mutant phenotype, due to complex epistatic genetic interactions between alleles in that background and the targeted locus. Hybrid crosses tend to eliminate homozygosity of alleles responsible for the abnormalities described above. In addition, the phenotypes of different hybrids (i.e., C57BL/6 129/J versus 129/J BALB/c) should be more alike than the phenotype of different inbred lines. For example, even though C57BL/6 is the only inbred line known to perform well in the Morris water maze, all F1 hybrid lines tested so far perform better than the C57BL/6 mice (24Upchurch M. Wehner J.M. Differences between inbred strains of mice in Morris water maze performance.Behav. Genet. 1988; 18: 55-68Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar). Therefore, even if genetic background is different between mice, the use of hybrids will facilitate the comparison and integration of results across experiments and among laboratories. Having already discussed the advantages of a common genetic background, what genetic background should be used? We suggest that a 50% C57BL/6 and 50% 129/J hybrid background may be a reasonable choice. One reason for choosing these strains is that laboratories that may ultimately use inbred C57BL/6 ES cell lines, as well as laboratories currently using established 129 ES lines, can both easily derive these mice. Also, hybrid mice similar to those depicted in Figure 2 can be produced easily and quickly soon after the derivation of a new targeted mutation (see below and Figure 3). As already noted, there is considerable variability among 129 substrains (19Simpson E.M. Linder C.C. Sargent E.E. Davisson M.T. Mobraaten L.E. Sharp J.J. Genetic variation among 129 substrains and its importance for “targeted mutagenesis” in mice.Nat. Genet. 1997; 16: 19-27Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar). Thus, to have a truly common background, a specific 129 substrain needs to be chosen. The 129/J substrain is fully inbred (19Simpson E.M. Linder C.C. Sargent E.E. Davisson M.T. Mobraaten L.E. Sharp J.J. Genetic variation among 129 substrains and its importance for “targeted mutagenesis” in mice.Nat. Genet. 1997; 16: 19-27Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar) and could be used for maintenance of mutant strains. Another closely related substrain that is also an excellent choice is 129/JEms. This strain was recently derived from 129/J such that it no longer segregates at the tyrosinase (Tyr) locus. F1 mice may not always be ideal. For example, the study of olfaction-dependent pregnancy block requires certain inbred strains (2Brennan P. Kaba H. Keverne E.B. Olfactory recognition a simple memory system.Science. 1990; 250: 1223-1226Crossref PubMed Scopus (290) Google Scholar). Additionally, it would be costly to study double mutants in an F1 hybrid background because the double mutants would be only 1/16 of the F1 progeny of double heterozygous parents. Nevertheless, whenever possible, it would be best to use F1 mice of the C57BL/6 129/J background. The derivation of F1 hybrid mice requires that the mutation is present in both C57BL/6 and 129/J inbred lines (Figure 2). Even with speed congenics, this transfer process may take as long as a year. It is possible to transfer a mutation to another background by backcrossing, but how complete should the transfer be? A congenic line made with unrelated strains is statistically expected to be 99.9% from the host after 10 generations of backcrossing (Mouse Nomenclature Guidelines, 1997). At the beginning of the backcrossing procedure, each additional backcross makes a significant contribution. However, after the fifth backcross generation, the returns of additional backcrossing decrease precipitously. We propose that incipient congenic colonies could be used even after five backcrosses, although clearly the backcrossing procedure should continue indefinitely. Because of the time required to derive the mutant mice, many gene-targeting studies have used an alternative strategy: chimeras with 129-derived ES cells are mated with C57BL/6 mice, and the resulting heterozygotes are intercrossed to produce F2 homozygous mutants (Figure 3). These mice are on average 50% 129 (from the ES cells) and 50% C57BL/6. Despite its intrinsic problems (see below), this breeding scheme may be a reasonable compromise between the conflicting demands of time and rigorous definition and control of genetic background. Note that we are not recommending the establishment and study of hybrid lines. In contrast to F1 mice that have one whole chromosome from each parent (Figure 2), F2 animals have a scrambling of parental genes that is on average 50% from each parent (Figure 3). The intrinsic variability of F2 animals could mask a weak phenotype. Therefore, whenever possible, it is preferable to use F1 homozygotes. For both F1 and F2 hybrid mice, WT littermates of the homozygous mutants may not be ideal controls. The region immediately surrounding the targeted locus is necessarily derived from the genetic background of the ES cells (e.g., 129) in homozygous mutants, while in their F2 WT littermates, the same region is always derived from the other parental strain (e.g., C57BL/6; Figure 3). Although all other genomic regions are randomly assorted between mutants and WT mice, genes linked to the targeted locus could have an impact on the analysis of the mutant phenotype, because there are differences between C57BL/6 and 129 inbred strains (3Collinge J. Whittington M. Sidle K. Smith C. Palmer M. Clarke A. Jefferys J. Prion protein is necessary for normal synaptic function.Nature. 1994; 370: 295-297Crossref PubMed Scopus (670) Google Scholar, 25Wehner J.M. Silva A. Importance of strain differences in evaluations of learning and memory processes in null mutants.Ment. Retard. Dev. Disabilities Res. Rev. 1996; 2: 243-248Crossref Google Scholar; Logue et al., 1997; 16Owen E.H. Logue S.F. Rasmussen D.F. Wehner J.M. Assessment of learning by the Morris water task and fear conditioning in inbred mouse strains and F1 hybrids implications of genetic background for single gene mutations and quantitative trait loci analyses.Neuroscience. 1997; in pressGoogle Scholar, 27Wolfer D.P. Stagliar-Bozizevic M. Müller U. Lipp H.-P. Assessing the effects of the 129Sv genetic background on swimming navigation learning in transgenic mutants a study using mice with a modified b-amyloid precursor gene.Brain Res. 1997; in pressGoogle Scholar). Genes within the genomic region linked to a given targeted locus could be responsible for some of these differences between strains, and thus in some cases confound the interpretation of the phenotype of the mutants. The best controls for the F2 homozygotes are WT mice that also have the genomic region linked to the targeted locus derived from the 129 ES cell strains. Such WT animals can be produced from crosses of F1 WT mice in which the locus of interest derives from the genetic background of the ES cells (Figure 3). The identification of these mice requires the isolation of polymorphisms within or near the targeted locus. If the phenotype of the two types of WT mice does not differ for the phenotypes studied, future experiments could simply use WT littermates as controls, thus avoiding the costly and laborious use of independently derived WT animals. Many of the problems and possible solutions discussed above for mice derived by targeted mutagenesis also apply to other kinds of transgenic mice. Mutant mice (and rats) can also be generated by random insertion of genes microinjected into the pronucleus of single zygotes. The situation is further complicated by new experimental strategies involving the derivation of compound mutant mice that result from crossing random-insertion transgenics with targeted mutants (e.g.,23Tsien J.Z. Chen D.F. Mercer E.H. Anderson D.J. Mayford M. Kandel E.R. Tonegawa S. Subregion- and cell type-restricted gene knockout in mouse brain.Cell. 1996; 87: 1317-1326Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (895) Google Scholar). Controlling for genetic background may be difficult in these experiments if the random-insertion and targeted-mutagenesis mice involved are maintained in non-inbred backgrounds. For example, without a common genetic background, it will be difficult to compare the overexpression of a gene (in random-insertion mice) with its deletion (in targeted mice). Similarly, experiments using random-insertion animals to rescue genes deleted in targeted mice would be hard to interpret if non-inbred genetic backgrounds are used. Without rigorous control for genetic background, the rescue could be due to the genetic background of the compound transgenic and not to the rescue transgene. New genetic strategies allow restriction of mutations to particular regions of the brain (23Tsien J.Z. Chen D.F. Mercer E.H. Anderson D.J. Mayford M. Kandel E.R. Tonegawa S. Subregion- and cell type-restricted gene knockout in mouse brain.Cell. 1996; 87: 1317-1326Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (895) Google Scholar) or the localized induction of genes (14Mayford M. Bach M.E. Huang Y.Y. Wang L. Hawkins R.D. Kandel E.R. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene.Science. 1996; 274: 1678-1683Crossref PubMed Scopus (1063) Google Scholar). Even in these experiments, genetic background remains an issue of central importance. As discussed above, if the genetic background of the mice is neither exactly defined nor easily recreated, it will be difficult to repeat and expand on these experiments, no matter how exciting the results. Considering all of the reasons discussed above, as well as our recommendations concerning targeted transgenic mice, we suggest that random-insertion transgenic mice should be derived in the C57BL/6 (or 129/J) inbred strain. In the future, methods other than the traditional pronuclear injection may become available for the generation of these mice (e.g., loxP-directed insertion of transgenic constructs into predetermined genomic sites in ES cell lines). Alternatively, congenic lines carrying the various insertions could be derived in the C57BL/6 background after the initial generation of the mice. The congenic mice could be used readily for crosses with targeted animals, and could also be used to generate F1 hybrids with mice of the 129/J genetic background. With a common genetic background, results with targeted animals could easily be integrated with findings from random-insertion studies. Maintenance of all of these transgenic lines should also follow the same general guidelines discussed above for gene-targeted mice. Mutants tend to be identified by the name of the manipulated gene, regardless of genetic background. This is a problem when seemingly identical mutations result in distinct phenotypes in different laboratories. Unfortunately, genes and the proteins that they encode are frequently thought of as autonomous functional entities with a defined role in complex biological phenomena. The implication of this simplistic view is that a genetic mutation should have similar impact regardless of the genetic background used. To emphasize the role of genetic background and to avoid ambiguity, authors should use appropriate abbreviations that denote both the gene manipulated and the genetic background of the mutants. It is important to note that many published studies have not followed the recommendations discussed above. This, however, does not mean that these studies should be discounted or mistrusted. In many cases, the conclusions were based on evidence from multiple studies involving a variety of approaches. Therefore, it is unlikely that genetic background was a confound in most of those experiments. Although the issues discussed above are not to be taken as ironclad requirements, they should be considered in the future design and description of neurogenetic studies. In evaluating these experiments, it may not be wise to use rigid prescriptions. Instead, each study should be evaluated for its own merits and in the context of other available information. For example, the nature of the experimental question, the known variability of the phenotype tested, and the natural range of phenotypes found among related non-mutant lines all can affect the impact that genetic background may have on the interpretation of the results. Clearly, a subtle behavioral phenotype resulting from a mutation of a poorly characterized gene should be interpreted with great caution. Controlling genetic background during the construction and testing of mutants is complex. Here, we propose that the genetic background of the mutants should always be described in detail, and that any background used should be easily recreated from available stocks. We also propose that both transgenic and gene-targeted mice be generated and maintained in inbred genetic backgrounds (i.e., either 129/J and/or C57BL/6). We propose the study of F1 hybrid mice whenever possible (50% C57BL/6 and 50% 129/J). It is important to standardize the genetic background of the mutants studied to facilitate the comparison of results between experiments and among laboratories. *Editor's note: These recommendations are those of the conference and the contributors and do not necessarily reflect the policy of Neuron or Cell Press. The following scientists made significant contributions to the recommendations in this article:

Using homologous recombination in embryonic stem cells, we have generated mice with a null mutation in the gene encoding the myelin-associated glycoprotein (MAG), a recognition molecule implicated in myelin formation. MAG-deficient mice appeared normal in motor coordination and spatial learning tasks. Normal myelin structure and nerve conduction in the PNS, with N-CAM overexpression at sites normally expressing MAG, suggested compensatory mechanisms. In the CNS, the onset of myelination was delayed, and subtle morphological abnormalities were detected in that the content of oligodendrocyte cytoplasm at the inner aspect of most myelin sheaths was reduced and that some axons were surrounded by two or more myelin sheaths. These observations suggest that MAG participates in the formation of the periaxonal cytoplasmic collar of oligodendrocytes and in the recognition between oligodendrocyte processes and axons.

Hyperphosphorylation of the microtubule-associated protein tau is a characteristic feature of neurodegenerative tauopathies including Alzheimer disease. Over-activation of proline-directed kinases, such as cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) and glycogen synthase kinase 3 (GSK3), has been implicated in the aberrant phosphorylation of tau at proline-directed sites. In this study we tested the roles of Cdk5 and GSK3 in tau hyperphosphorylation in vivo using transgenic mice with p25-induced Cdk5 over-activation. We found that over-activation of Cdk5 in young transgenic animals does not induce tau hyperphosphorylation at sites recognized by the antibodies AT8, AT100, PHF-1, and TG3. In fact, we observed that Cdk5 over-activation leads to inhibition of GSK3. However, in old transgenic animals the inhibition of GSK3 is lost and results in increased GSK3 activity, which coincides with tau hyperphosphorylation at the AT8 and PHF-1 sites. Pharmacological inhibition of GSK3 in old transgenic mice by chronic treatment with lithium leads to a reduction of the age-dependent increase in tau hyperphosphorylation. Furthermore, we found that Cdk5, GSK3, and PP2A co-immunoprecipitate, suggesting a functional association of these molecules. Together, these results reveal the role of GSK3 as a key mediator of tau hyperphosphorylation, whereas Cdk5 acts as a modulator of tau hyperphosphorylation via the inhibitory regulation of GSK3. Furthermore, these findings suggest that disruption of regulation of GSK3 activity underlies tau hyperphosphorylation in neurodegenerative tauopathies. Hence, GSK3 may be a prime target for therapeutic intervention in tauopathies including Alzheimer disease. Hyperphosphorylation of the microtubule-associated protein tau is a characteristic feature of neurodegenerative tauopathies including Alzheimer disease. Over-activation of proline-directed kinases, such as cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) and glycogen synthase kinase 3 (GSK3), has been implicated in the aberrant phosphorylation of tau at proline-directed sites. In this study we tested the roles of Cdk5 and GSK3 in tau hyperphosphorylation in vivo using transgenic mice with p25-induced Cdk5 over-activation. We found that over-activation of Cdk5 in young transgenic animals does not induce tau hyperphosphorylation at sites recognized by the antibodies AT8, AT100, PHF-1, and TG3. In fact, we observed that Cdk5 over-activation leads to inhibition of GSK3. However, in old transgenic animals the inhibition of GSK3 is lost and results in increased GSK3 activity, which coincides with tau hyperphosphorylation at the AT8 and PHF-1 sites. Pharmacological inhibition of GSK3 in old transgenic mice by chronic treatment with lithium leads to a reduction of the age-dependent increase in tau hyperphosphorylation. Furthermore, we found that Cdk5, GSK3, and PP2A co-immunoprecipitate, suggesting a functional association of these molecules. Together, these results reveal the role of GSK3 as a key mediator of tau hyperphosphorylation, whereas Cdk5 acts as a modulator of tau hyperphosphorylation via the inhibitory regulation of GSK3. Furthermore, these findings suggest that disruption of regulation of GSK3 activity underlies tau hyperphosphorylation in neurodegenerative tauopathies. Hence, GSK3 may be a prime target for therapeutic intervention in tauopathies including Alzheimer disease. Neurodegenerative tauopathies, including Alzheimer disease (AD), 3The abbreviations used are: AD, Alzheimer disease; APP, amyloid precursor protein; Cdk5, cyclin-dependent kinase 5; ERK, extracellular signal-regulated kinase; GSK-3, glycogen synthase kinase 3; IP, immunoprecipitation; JNK, c-Jun N-terminal kinase; MAPK, mitogen-activated protein kinase; MEK, MAPK/ERK kinase; PP1, protein phosphatase 1; PP2A, protein phosphatase 2A; TBS, Tris-buffered saline; TG, transgenic; WT, wild-type; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid. are characterized by abnormal hyperphosphorylation of the microtubule-associated protein tau at proline-directed serine/threonine phosphorylation sites (1Lee V.M.Y. Goedert M. Trojanowski J.Q. Annu. Rev. Neurosci. 2001; 24: 1121-1159Crossref PubMed Scopus (2162) Google Scholar). Amongst the main aberrantly hyperphosphorylated sites on tau are the pathological phosphosites Ser-202/Thr-205 (AT8 site), Ser-214 and/or Ser-212 (AT100 site), Thr-231 and/or Ser-235 (TG3 site), and Ser-396/Ser-404 (PHF-1 site) (1Lee V.M.Y. Goedert M. Trojanowski J.Q. Annu. Rev. Neurosci. 2001; 24: 1121-1159Crossref PubMed Scopus (2162) Google Scholar, 2Drechsel D.N. Hyman A.A. Cobb M.H. Kirschner M.W. Mol. Biol. Cell. 1992; 3: 1141-1154Crossref PubMed Scopus (774) Google Scholar, 3Buee L. Bussiere T. Buee-Scherrer V. Delacourte A. Hof P.R. Brain. Res. Rev. 2000; 33: 95-130Crossref PubMed Scopus (1574) Google Scholar). A well characterized function of tau is the assembly and stabilization of microtubules (1Lee V.M.Y. Goedert M. Trojanowski J.Q. Annu. Rev. Neurosci. 2001; 24: 1121-1159Crossref PubMed Scopus (2162) Google Scholar, 2Drechsel D.N. Hyman A.A. Cobb M.H. Kirschner M.W. Mol. Biol. Cell. 1992; 3: 1141-1154Crossref PubMed Scopus (774) Google Scholar, 3Buee L. Bussiere T. Buee-Scherrer V. Delacourte A. Hof P.R. Brain. Res. Rev. 2000; 33: 95-130Crossref PubMed Scopus (1574) Google Scholar). Tau binds directly to microtubules and promotes microtubule polymerization (2Drechsel D.N. Hyman A.A. Cobb M.H. Kirschner M.W. Mol. Biol. Cell. 1992; 3: 1141-1154Crossref PubMed Scopus (774) Google Scholar, 3Buee L. Bussiere T. Buee-Scherrer V. Delacourte A. Hof P.R. Brain. Res. Rev. 2000; 33: 95-130Crossref PubMed Scopus (1574) Google Scholar). Increasing phosphorylation of tau leads to its dissociation from microtubules and in turn to microtubule destabilization (4Bramblett G.T. Goedert M. Jakes R. Merrick S.E. Trojanowski J.Q. Lee V.M.Y. Neuron. 1993; 10: 1089-1099Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (765) Google Scholar, 5Biernat J. Guske N. Drewes G. Mandelkow E.M. Mandelkow E. Neuron. 1993; 11: 153-163Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (651) Google Scholar). The interaction of tau and microtubules also plays an important role in the regulation of microtubule-dependent axonal transport (6Stamer K. Vogel R. Thies E. Mandelkow E. Mandelkow E.M. J. Cell Biol. 2002; 156: 1051-1063Crossref PubMed Scopus (752) Google Scholar, 7Mandelkow E.M. Thies E. Trinczek B. Biernat J. Mandelkow E. J. Cell Biol. 2004; 167: 99-110Crossref PubMed Scopus (221) Google Scholar). A recent study proposed that deficient axonal transport may be important in the early stages of pathogenesis of AD (8Stokin G.B. Lillo C. Falzone T.L. Brusch R.G. Rockenstein E. Mount S.L. Raman R. Davies P. Masliah E. Williams D.S. Goldstein L.S.B. Science. 2005; 307: 1282-1288Crossref PubMed Scopus (981) Google Scholar). Precise regulation of phosphorylation of tau is probably important for its normal cellular functions; aberrant tau hyperphosphorylation is believed to disrupt cellular processes such as axonal transport. However, it is still not established what the physiological importance of the individual tau phosphorylation sites is. The normal phosphorylation state of tau is balanced by antagonistic kinase and phosphatase activity. Thus, numerous protein kinases and protein phosphatases have been implicated in the abnormal hyperphosphorylation of tau (for review, see Ref. 3Buee L. Bussiere T. Buee-Scherrer V. Delacourte A. Hof P.R. Brain. Res. Rev. 2000; 33: 95-130Crossref PubMed Scopus (1574) Google Scholar). The proline-directed serine/threonine kinases, cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) and glycogen synthase kinase 3 (GSK3), have been identified as prime candidates mediating aberrant tau phosphorylation at disease-associated sites (9Hanger D.P. Hughes K. Woodgett J.R. Brion J.P. Anderton B.H. Neurosci. Lett. 1992; 147: 58-62Crossref PubMed Scopus (657) Google Scholar, 10Ishiguro K. Takamatsu M. Tomizawa K. Omori A. Takahashi M. Arioka M. Uchida T. Imahori K. J. Biol. Chem. 1992; 267: 10897-10901Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 11Mandelkow E.M. Drewes G. Biernat J. Gustke N. Van Lint J. Vandenheede J.R. Mandelkow E. FEBS Lett. 1992; 314: 315-321Crossref PubMed Scopus (483) Google Scholar, 12Paudel H.K. Lew J. Ali Z. Wang J.H. J. Biol. Chem. 1993; 268: 23512-23518Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Cdk5 co-localizes with filamentous tau deposits and has increased activity in several tauopathies, including AD (Refs. 13Liu F. Su Y. Li B. Zhou Y. Ryder J. Gonzalez-DeWhitt P. May P.C. Ni B. FEBS Lett. 2003; 547: 193-196Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar, 14Nakamura S. Kawamoto Y. Nakano S. Ikemoto A. Akiguchi I. Kimura J. Neurology. 1997; 48: 267-270Crossref PubMed Scopus (48) Google Scholar, 15Patrick G.N. Zukerberg L. Nikolic M. de la Monte S. Dikkes P. Tsai L.H. Nature. 1999; 402: 615-622Crossref PubMed Scopus (1323) Google Scholar; for review, see Ref. 16Shelton S.B. Johnson G.V.W. J. Neurochem. 2004; 88: 1313-1326Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar). GSK3 generates disease-associated phospho-epitopes on tau (17Nishimura I. Yang Y. Lu B. Cell. 2004; 116: 671-682Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (278) Google Scholar) and co-localizes with aggregates of hyperphosphorylated tau (18Ishizawa T. Sahara N. Ishiguro K. Kersh J. McGowan E. Lewis J. Hutton M. Dickson D.W. Yen S.H. Am. J. Pathol. 2003; 163: 1057-1067Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (89) Google Scholar). Based on this, much research effort has been focused on the development of specific inhibitors for Cdk5 and GSK3 as potential therapeutic treatments in tauopathies (for review, see Refs. 19Lau L.F. Seymour P.A. Sanner M.A. Schachter J.B. J. Mol. Neurosci. 2002; 19: 267-273Crossref PubMed Scopus (53) Google Scholar and 20Cohen P. Goedert M. Nat. Rev. Drug Discov. 2004; 3: 479-487Crossref PubMed Scopus (677) Google Scholar). However, the roles of Cdk5 and GSK3 in tau hyperphosphorylation are not fully established, and it still remains to determine the critical factors leading to abnormal tau hyperphosphorylation in tauopathies. In the present study we have used a transgenic (TG) mouse line expressing low levels of the Cdk5 activator p25 (21Angelo M. Plattner F. Irvine E.E. Giese K.P. Eur. J. Neurosci. 2003; 18: 423-431Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar) to analyze in vivo the impact of Cdk5 over-activation on tau hyperphosphorylation. We assessed the phosphorylation state of tau at sites characteristically hyperphosphorylated in tauopathies including the AT8, AT100, TG3, and PHF-1 sites. Surprisingly, we find that activation of Cdk5 does not affect tau hyperphosphorylation at these sites in young TG mice. However, p25-induced Cdk5 over-activation leads to inhibition of GSK3. This inhibitory cross-talk of Cdk5 and GSK3 is correlated with the finding that Cdk5 and GSK3 are associated in a complex. In old TG mice the inhibitory regulation of GSK3 is lost, and GSK3 activity is significantly increased. Furthermore, in old TG mice we observe increased phosphorylation at the AT8 and PHF-1 sites, which accords with the enhanced GSK3 activity. Consistently, we find that pharmacological inhibition of GSK3 with lithium leads to a reduction of the increased tau phosphorylation in old TG mice. Our study shows for the first time in vivo that Cdk5 can indirectly affect tau hyperphosphorylation via the regulation of GSK3 activity and establishes GSK3 as a key mediator of tau phosphorylation at disease-associated sites. Hence, these results suggest GSK3 as a prime target for therapeutic intervention in neurodegenerative tauopathies, whereas inhibition of Cdk5 may be inappropriate as a treatment for tauopathies. Animals—Heterozygous p25 TG mice and wild-type (WT) control littermates in the C57BL/6 genetic background were bred and genotyped by PCR analysis as reported (21Angelo M. Plattner F. Irvine E.E. Giese K.P. Eur. J. Neurosci. 2003; 18: 423-431Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar). The mice were housed in groups of 2-5 and treated according to the Animals (Scientific Procedures) Act or 1986, UK. Antibodies and Reagents—Primary antibodies used for immunoblotting are listed in Table 1. Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies were from Perbio, and protease inhibitor Complete tablets EDTA-free were from Roche. All chemicals were from Sigma unless stated otherwise.TABLE 1Antibodies used for immunoblottingAntibodyEpitopeIsotypeBufferDilutionSourceCdk5 (C-8)Cdk5 C terminusRabbit IgGMilk1:200Santa Cruzp35 (C-19)p35 and p25 C terminusRabbit IgGMilk1:200Santa Cruz4G-1ETotal GSK3α/βMouse IgGMilk1:1000Upstate9332Total GSK3βRabbit IgGMilk1:1000Cell Signaling Technology9331Phospho-GSK3α/β (Ser-21/9)Rabbit IgGMilk1:1000Cell Signaling Technology5G-2FPhospho-GSK3α/β (Tyr-279/216)Mouse IgGMilk1:1000UpstateAT-8Tau phospho-Ser-202/205Mouse IgGMilk1:1000PierceAT-100Tau phospho-Thr-212/S214Mouse IgGBSA1:2000InnogeneticsPHF1Tau phospho-Ser-396/404Mouse IgGMilk1:100P. DaviesTG3Tau phospho-Thr-231/S235, conformation-dependentMouse IgMBSA1:100P. DaviesBR134Pan-tauRabbit IgGMilk1:750M. GoedertTAU-5Pan-tau (residues 220–240)Mouse IgGMilk1:1000ChemiconSMI31Phospho-neurofilament antibody cross-reacting with PHF-1 site on tauMouse IgGMilk1:1000Sternberger Monoclonals, Inc.9562β-CateninRabbit IgGBSA1:3000Cell Signaling Technology06-182Total ERK1/2Mouse IgGMilk1:1000Upstate4377Phospho-ERK1/2 (Thr-202/Tyr-204)Monoclonal rabbit IgGBSA1:1000Cell Signaling Technology9121Phospho-MEK1/2 (Ser-217/221)Rabbit IgGBSA1:1000Cell Signaling Technology9251Phospho-SAPK/JNK (Thr-183/Tyr-185)aSAPK, stress-activated protein kinaseRabbig IgGBSA1:1000Cell Signaling TechnologyPP2AcCatalytic subunit of PP2AMouse IgGMilk1:1000S. M. DilworthPR65/AScaffolding/regulatory subunit of PP2AMouse IgGMilk1:1000S. M. Dilworthsc-7482Catalytic subunit of PP1 (total protein)Mouse IgGMilk1:2000Santa Cruz2581Phospho-PP1 (Thr-320)Rabbit IgGBSA1:500Cell Signaling Technology2452APP (around unphosphorylated Thr-668)Rabbit IgGBSA1:1000Cell Signaling Technology2451Phospho-APP (Thr-668)Rabbit IgGBSA1:1000Cell Signaling TechnologyA5441β-ActinMouse IgGMilk1:50000SigmaS2177SynaptotagminRabbit IgGMilk1:40000Sigmaa SAPK, stress-activated protein kinase Open table in a new tab Lysate Preparation—Mice were euthanized using CO2, the brain was quickly removed, and the hippocampus was dissected in 4 °C lysate buffer. The hippocampi were Dounce-homogenized in 4 °C lysate buffer and stored at -80 °C. The lysate buffer (10 mm Tris, pH 7.4, 320 mm sucrose, 1% Triton X-100, 1% CHAPS and 0.025% NaN3) contained phosphatase and protease inhibitors (1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 50 mm sodium fluoride, 2 mm sodium orthovanadate, 0.1 mm ammonium molybdate, 0.2 mm phenylarsine oxide, and Complete tablets). Protein concentrations were determined with the BCA assay (Perbio). Immunoblot Analysis—Equal amounts of protein were separated on 4-16% polyacrylamide gels (Bio-Rad), transferred onto polyvinylidene difluoride membranes (Bio-Rad), and incubated in blocking buffer consisting of TBS (10 mm Tris, pH 7.6, and 150 mm NaCl) with either 3% milk or 3% bovine serum albumin. Blots were incubated overnight at 4 °C with primary antibodies (Table 1) in blocking buffer. After washing in several volumes of TBS with 0.05% Tween 20 (TBST), the blots were incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies in blocking buffer and washed again in TBST, and signals were visualized with the enhanced chemiluminescent system (Perbio). Band intensities from x-ray film (Amersham Biosciences) were quantified with Densitometer Quantity One (Bio-Rad) in the linear range. Blots were stripped with stripping buffer (Perbio) and reprobed with anti-β-actin and anti-synaptotagmin antibody to normalize for the amount of loaded protein. Immunoprecipitation (IP)—Hippocampal lysate with a protein content of 1 mg was diluted in 1 ml of ice-cold IP buffer (150 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, pH 7.6, 1% Triton X-100, 0.025% NaN3) with protease and phosphatase inhibitors. The IP mix was precleared, and 5 μg of GSK3β antibody were added. The mix was incubated for 3 h on a rotator at 4 °C. One hundred microliters of IgG bead slurry were added and rotated for 3 h at 4 °C. The beads were washed 3 times with 1 ml of ice-cold IP buffer containing protease and phosphatase inhibitors. The sample was denatured in 50 μl of SDS sample loading buffer at 90 °C for 15 min, separated on 4-16% polyacrylamide gels (Bio-Rad), and transferred onto polyvinylidene difluoride membranes (Bio-Rad). Immunoblot analysis of IP using rabbit IgG primary antibodies was visualized with True Blot horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (eBioscience) detecting only native, un-denatured rabbit IgG. Cdk5 Activity Assay—Lysate containing 200 μg of protein was diluted in 350 μl IP buffer (150 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, pH 7.6, 1% Triton X-100, 0.025% NaN3) containing protease and phosphatase inhibitors and centrifuged, and supernatant was transferred to a new tube. One microgram of anti-Cdk5 antibody was added per tube, and the mix incubated for 1.5 h at 4 °C under constant shaking. Thirty microliters of protein A bead slurry were added and incubated for 1.5 h at 4 °C under constant shaking. After settling of the beads, the supernatant was discarded, and the beads were washed 3 times with 400 μl of IP buffer. Forty microliters of the kinase reaction mix (20 mm Tris, pH 7.6, 25 mm MgCl2, 1 mm EDTA, 0.5 mm β-glycerol phosphate, 0.2 mm sodium orthovanadate) containing 20 μg of the Cdk5 substrate histone 1 (Upstate) and the inhibitor mixture (Upstate) with 5 μm protein kinase C inhibitor peptide, 0.5 μm cyclic AMP-dependent protein kinase A inhibitor peptide, and 0.5 μm Compound R24571 were added to the beads. The reaction was initiated by the addition of 10 μl of 100 μm ATP solution containing 5 μCi of radioactive-labeled [γ-32P]ATP (GE Healthcare). The samples were incubated for 30-60 min at 30 °C. The reaction was stopped by spotting 25 μl of assay mix on p81 nitrocellulose paper (Upstate). The paper was washed 3 times in 0.75% phosphoric acid and once with acetone. The radioactivity was measured by Cherenkov counting using 25 ml of polyethylene scintillation vials filled with 12 ml of H2O. Cdk5 activity was calculated as the difference between the activity with and without the presence of 10 μm roscovitine, a Cdk5 inhibitor. GSK3 Activity Assay—The GSK3 activity assay was performed similarly to the Cdk5 activity assay with the following changes; lysate containing 100 μg of protein was immunoprecipitated with 1 μg of anti-GSK3β antibody. The kinase reaction mix contained 5 μg of the GSK3 substrate phospho-glycogen synthase peptide-2 (Upstate), 0.2 μm okadaic acid (a protein phosphatase 1 and 2A (PP1; PP2A) inhibitor), and 10 μm roscovitine (a Cdk5 inhibitor). The kinase reaction mix was incubated for 1.5 h at 30 °C. GSK3 activity was calculated as the difference between the activity with and without the presence of 10 mm LiCl, a GSK3 inhibitor. Chronic Lithium Administration—22-24-month-old TG mice (n = 4) and 18-19-month-old WT mice (n = 3) were chronically treated with lithium for 1 month. For the injection, a 0.1 m LiCl solution was prepared and filter-sterilized. The first 2 days the mice were injected intraperitoneally with 1.5 meq/kg LiCl (corresponding to 10.4 mg/kg). From days 3-7 a dose of 3 meq/kg was administered. Control aged p25 transgenic mice (n = 4) were injected with saline. Thereafter, the mice were fed with powdered chow containing 1.7 g of LiCl/kg of chow for 3 weeks. Control aged p25 transgenic mice were given powdered chow without LiCl. To prevent hyponatremia, water and 400 mm NaCl solution were available ad libitum to the mice. Data Analysis—Statistical analysis was performed using one-way analysis of variance. Data are expressed as the mean ± S.E. Age-dependent Increase in Tau Hyperphosphorylation in p25 TG Mice with Constant Cdk5 Over-activation—In this study we analyzed a TG mouse line expressing the Cdk5 activator p25 to investigate in vivo the roles of Cdk5 and GSK3 in tau hyperphosphorylation. Our transgenic mouse line, in which the p25 transgene is driven by the α-Ca2+/calmodulin-dependent kinase II promoter, displayed low level postnatal p25 expression restricted to forebrain, with the highest levels found in the hippocampus (21Angelo M. Plattner F. Irvine E.E. Giese K.P. Eur. J. Neurosci. 2003; 18: 423-431Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 22Ris L. Angelo M. Plattner F. Capron B. Errington M.L. Bliss T.V. Godaux E. Giese K.P. Eur. J. Neurosci. 2005; 21: 3023-3033Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar). Hence, we focused on biochemical changes in the hippocampus, a brain area affected in many tauopathies, including AD (1Lee V.M.Y. Goedert M. Trojanowski J.Q. Annu. Rev. Neurosci. 2001; 24: 1121-1159Crossref PubMed Scopus (2162) Google Scholar, 23Braak H. Braak E. Acta Neuropathol. (Berl.). 1991; 82: 239-259Crossref PubMed Scopus (11766) Google Scholar). We examined the impact of p25-induced Cdk5 over-activation on the phosphorylation level of tau at sites abnormally hyperphosphorylated in tauopathies in both young (3 months) and old (18 months) p25 TG mice. To investigate these disease-related phosphorylation sites on tau, we used phospho-specific antibodies commonly employed in neuropathological studies that recognize aberrantly hyperphosphorylated epitopes on tau including AT8 (Ser-202/Thr-205), AT100 (Thr-214 and/or Ser-212), TG3 (Thr-231/Ser-235), and PHF-1 (Ser-396/Ser-404). We observed an age-dependent increase in tau hyperphosphorylated at the AT-8 site and PHF-1 site in the hippocampus of TG mice (Fig. 1, A and B). In young TG mice no enhanced tau hyperphosphorylation was observed with these antibodies (Fig. 1, A and B; supplemental Fig. 1) even though Cdk5 activity was constantly increased by ∼2-fold as demonstrated by a Cdk5 kinase activity assay (Fig. 2D). In contrast, old TG mice displayed significantly elevated levels of tau phosphorylation by ∼90% using both AT8 and PHF-1 antibodies (Fig. 1, A and B). The results of the PHF-1 antibody were confirmed with the phosphorylation-dependent neurofilament antibody, SMI31, known to cross-react with tau hyperphosphorylated at the PHF-1 site (24Lichtenberg-Kraag B. Mandelkow E.M. Biernat J. Steiner B. Schroter C. Gustke N. Meyer H.E. Mandelkow E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 5384-5388Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar). The SMI31 antibody showed no changes in young mice but revealed increased tau hyperphosphorylation in old TG mice (Fig. 1, A and B). The antibodies AT100 and TG3 did not detect significant changes in phosphorylation levels between TG and WT mice at an old age (Fig. 1A and supplemental Fig. 1).FIGURE 2Constant Cdk5 over-activation induced by p25 expression in the hippocampus of TG mice. A, no age-dependent changes in expression of p25 and Cdk5 between genotypes were found. Immunoblots of hippocampal lysates from 3- and 18-month-old WT and TG mice were probed with C-19 (antibody detecting the Cdk5 activator proteins, p25 and p35) and Cdk5-specific antibodies. B, Cdk5 activity (mean ± S.E.) was increased by ∼2-fold in both young and old TG mice as compared with WT mice (3-month, n = 4, F1,6 = 29.0, **, p < 0.01; 18-month, n = 4, F1,6 = 33.2, **, p < 0.01). C, increased phosphorylation levels of APP (pAPP) at the Cdk5-specific site Thr-668 (as per APP695 isoform) were detected in hippocampal lysate from 3- and 18-month-old TG mice as compared with WT mice. No differences in total protein levels of APP were detected between genotypes as tested with an antibody against an unphosphorylated epitope around Thr-668 on APP. D, quantification of phospho-APP (Thr-668) signal demonstrated an ∼60% increase in TG mice both at 3 months (n = 6, F1,10 = 11.1, **, p < 0.01) and 18 months (n = 4, F1,6 = 175, ***, p < 0.001).View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) To determine whether the age-dependent increase in tau hyperphosphorylation was related to changes in expression levels of p25, p35, and Cdk5 or the level of Cdk5 activity, we examined these parameters in young and old WT and TG mice. The p25 transgene was expressed constantly at low levels at around 33% of endogenous p35 expression (Fig. 2A and Ref. 21Angelo M. Plattner F. Irvine E.E. Giese K.P. Eur. J. Neurosci. 2003; 18: 423-431Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar). No age-dependent changes were detected in the expression levels of p35 and Cdk5 (Fig. 2A). Consistent with these results, Cdk5 kinase activity was increased ∼2-fold in both young and old TG mice as compared with WT controls (Fig. 2B). Thus, an age-dependent alteration in Cdk5 activity cannot account for the age-dependent hyperphosphorylation of tau at the disease-related sites. Furthermore, we assessed the level of phosphorylation of the amyloid precursor protein (APP) at the proline-directed site Thr-668 (annotated as per APP695 isoform). This site is specifically phosphorylated by Cdk5 and, hence, displays enhanced levels of phosphorylation in p25-expressing TG mice with over-activation of Cdk5 (25Iijima K. Ando K. Takeda S. Satoh Y. Seki T. Itohara S. Greengard P. Kirino Y. Nairn A.C. Suzuki T. J. Neurochem. 2000; 75: 1085-1091Crossref PubMed Scopus (208) Google Scholar, 26Cruz J.C. Tseng H.C. Goldman J.A. Shih H. Tsai L.H. Neuron. 2003; 40: 471-483Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (505) Google Scholar). Consistently, we found that the phosphorylation of APP at Thr-668 was significantly increased by ∼60% in both young and aged TG mice as compared with control WT mice (Fig. 2, C and D). No changes in total APP protein levels were observed (Fig. 2C). This constant elevation of APP phosphorylation in the TG mice is in accordance with the results of the Cdk5 kinase activity assay. Together, these results confirm that Cdk5 activity is constantly increased in vivo in the p25 TG mice. Nevertheless, the p25-induced Cdk5 over-activation does not induce hyperphosphorylation at the assessed disease-associated sites on tau in young TG mice. However, in old TG mice the level of phosphorylation was significantly increased both at the AT8 and PHF-1 sites on tau. Age-dependent Inhibitory Regulation of GSK3 Activity in p25 TG Mice—Because there were no age-related changes in the activity of Cdk5 to account for the increased tau phosphorylation in the TG mice, we studied the involvement of other proline-directed kinases that have been linked to aberrant tau hyperphosphorylation (1Lee V.M.Y. Goedert M. Trojanowski J.Q. Annu. Rev. Neurosci. 2001; 24: 1121-1159Crossref PubMed Scopus (2162) Google Scholar, 3Buee L. Bussiere T. Buee-Scherrer V. Delacourte A. Hof P.R. Brain. Res. Rev. 2000; 33: 95-130Crossref PubMed Scopus (1574) Google Scholar). First, we tested the phosphorylation levels of the activating regulatory sites of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), c-Jun N-terminal kinase (JNK), and MAPK/ERK kinase 1/2 (MEK1/2). We observed no differences in the phosphorylation levels of the activating regulatory sites on JNK and MEK1/2 (Fig. 3A and supplemental Fig. 2). The phosphorylation level at the activation site of ERK was reduced in TG mice as compared with WT controls (Fig. 3, A and B). This is consistent with the observation that Cdk5 regulates the activity of ERK via the inhibition of MEK1 (27Sharma P. Veeranna Sharma M. Amin N.D. Sihag R.K. Grant P. Ahn N. Kulkarni A.B. Pant H.C. J. Biol. Chem. 2002; 277: 528-534Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar). Assessment of the phosphorylation level of the regulatory sites of GSK3 revealed a significant change between TG mice and WT controls. GSK3 is one of the major candidate mediators of tau hyperphosphorylation in tauopathies and has been shown to phosphorylate proline-directed serine/threonine sites similarly to Cdk5 (Ref. 7Mandelkow E.M. Thies E. Trinczek B. Biernat J. Mandelkow E. J. Cell Biol. 2004; 167: 99-110Crossref PubMed Scopus (221) Google Scholar; for review, see Ref. 3Buee L. Bussiere T. Buee-Scherrer V. Delacourte A. Hof P.R. Brain. Res. Rev. 2000; 33: 95-130Crossref PubMed Scopus (1574) Google Scholar). One particular feature of GSK3 is that it requires priming of some of its phosphorylation sites by other kinases such as cyclic AMP-dependent protein kinase A and Cdk5 (28Sengupta A. Wu Q. Grundke-Iqbal I. Iqbal K. Singh T.J. Mol. Cell. Biochem. 1997; 167: 99-105Crossref PubMed Scopus (154) Google Scholar, 29Dajani R. Fraser E. Roe S.M. Young N. Good V. Dale T.C. Pear L.H. Cell. 2001; 105: 721-732Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (588) Google Scholar). It has been proposed that once the priming sites on tau are modified, GSK3 is able to sequentially phosphorylate adjacent sites and, hence, induce hyperphosphorylation (30Cho J.H. Johnson G.V. J. Biol. Chem. 2003; 278: 187-193Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (212) Google Scholar). GSK3 activity is regulated by antagonistic serine and tyrosine phosphorylation. Phosphorylation at Ser-9 in the β-isoform and at Ser-21 in the α-isoform inhibits GSK3 (31Stambolic V. Woodgett J.R. Biochem. J. 1994; 303: 701-704Crossref PubMed Scopus (512) Google Scholar), whereas phosphorylation of Tyr-216 in the β-isoform and Tyr-279 in the α-isoform is essential for GSK3 activation (32Hughes K. Nikolakaki E. Plyte S.E. Totty N.F. Woodgett J.R. EMBO J. 1993; 12: 803-808Crossref PubMed Scopus (525) Google Scholar). We observed that the activity of GSK3 was differentially regulated in TG mice. In young TG mice, phosphorylation of GSK3β at the inhibitory site was significantly increased by ∼85% (Fig. 4,

Abstract Glycogen synthase kinase‐3 (GSK‐3) is a serine/threonine kinase regulating diverse cellular functions including metabolism, transcription and cell survival. Numerous intracellular signalling pathways converge on GSK‐3 and regulate its activity via inhibitory serine‐phosphorylation. Recently, GSK‐3 has been involved in learning and memory and in neurodegeneration. Here, we present evidence that implicates GSK‐3 in synaptic plasticity. We show that phosphorylation at the inhibitory Ser9 site on GSK‐3β is increased upon induction of long‐term potentiation (LTP) in both hippocampal subregions CA1 and the dentate gyrus (DG) in vivo . The increase in inhibitory GSK‐3β phosphorylation is robust and persists for at least one hour postinduction. Furthermore, we find that LTP is impaired in transgenic mice conditionally overexpressing GSK‐3β. The LTP deficits can be attenuated/rescued by chronic treatment with lithium, a GSK‐3 inhibitor. These results suggest that the inhibition of GSK‐3 facilitates the induction of LTP and this might explain some of the negative effects of GSK‐3 on learning and memory. It follows that this role of GSK‐3β in LTP might underlie some of the cognitive dysfunction in diseases where GSK‐3 dysfunction has been implicated, including Alzheimer's and other dementias.

ABSTRACT Neuronal activity-dependent transcription directs molecular processes that regulate synaptic plasticity, brain circuit development, behavioral adaptation, and long-term memory. Single cell RNA-sequencing technologies (scRNAseq) are rapidly developing and allow for the interrogation of activity-dependent transcription at cellular resolution. Here, we present NEUROeSTIMator, a deep learning model that integrates transcriptomic signals to estimate neuronal activation in a way that we demonstrate is associated with Patch-seq electrophysiological features and that is robust against differences in species, cell type, and brain region. We demonstrate this method’s ability to accurately detect neuronal activity in previously published studies of single cell activity-induced gene expression. Further, we applied our model in a spatial transcriptomic study to identify unique patterns of learning-induced activity across different brain regions. Altogether, our findings establish NEUROeSTIMator as a powerful and broadly applicable tool for measuring neuronal activation, whether as a critical covariate or a primary readout of interest.

Abstract The mechanisms underlying memory loss associated with Alzheimer’s disease and related dementias (ADRD) remain unclear, and no effective treatments exist. Fundamental studies have shown that a set of transcriptional regulatory proteins of the nuclear receptor 4a (Nr4a) family serve as molecular switches for long-term memory. Here, we show that Nr4a proteins regulate the transcription of a group of genes encoding chaperones that localize to the endoplasmic reticulum (ER), which function to traffic plasticity-related proteins to the cell surface during long lasting forms of synaptic plasticity and memory. Nr4a transcription factors and ER chaperones are linked to ADRD in human samples as well as mouse models, and overexpressing Nr4a1 or the ER chaperone Hspa5 ameliorates the long-term memory deficits in a tau-based mouse model of ADRD, pointing towards novel therapeutic approaches for treating memory loss. Thus, our findings establish protein folding in the ER as a novel molecular concept underlying long-term memory, providing new insights into the mechanistic basis of cognitive deficits in dementia. One-Sentence Summary Molecular approaches establish protein folding in the endoplasmic reticulum as a novel molecular concept underlying synaptic plasticity and memory, serving as a switch to regulate protein folding and trafficking, and driving cognitive deficits in neurodegenerative disorders.

Abstract CREB-dependent transcription necessary for long-term memory is driven by interactions with CREB-binding protein (CBP), a multi-domain protein that binds numerous transcription factors. Identifying specific domain functions for multi-action proteins is essential to understand processes necessary for healthy living including cognitive function and a robust circadian clock. We investigated the function of the CBP KIX domain in hippocampal memory and gene expression using CBP KIX/KIX mice with mutations that prevent phospho-CREB (Ser133) binding. We found that CBP KIX/KIX mice were impaired in long-term, but not short-term spatial memory in the Morris water maze. Using an unbiased analysis of gene expression after training for hippocampus-dependent memory, we discovered dysregulation of CREB and CLOCK target genes and downregulation of circadian genes in CBP KIX/KIX mice. With our finding that the CBP KIX domain was important for transcription of circadian genes, we profiled circadian activity in CBP KIX/KIX mice. CBP KIX/KIX mice exhibited delayed activity peaks after light offset and longer free-running periods in constant dark, although phase resetting to light was comparable to wildtype. These studies provide insight into the significance of the CBP KIX domain by defining targets of CBP transcriptional co-activation in memory and the role of the CBP KIX domain in vivo on circadian rhythms.