Abstract Seasonal daylength has been linked to the development and prevalence of mood disorders, however, the neural mechanisms underlying this relationship remain unknown. Previous work in our laboratory has shown that developmental exposure to seasonal photoperiods has enduring effects on the activity of mouse dorsal raphe serotonergic neurons, their intrinsic electrical properties, as well as on depression and anxiety-related behaviors. Here we focus on the possible ionic mechanisms that underlie the observed photoperiodic programming of the electrophysiological properties of serotonin neurons, focusing on the twin-pore K+ channels TREK-1 and TASK-1 that set resting membrane potential and regulate excitability. Using multielectrode array recordings in ex vivo dorsal raphe slices, we examined the effects of pharmacological inhibition of these channels on the spike rates of serotonin neurons of mice from different photoperiods. Pharmacological inhibition of TREK-1 significantly increased spike frequency in Short and Equinox photoperiod cohorts, but did not further elevate the firing rate in slices from Long photoperiod mice, suggesting that TREK-1 function is reduced in Long photoperiods. In contrast, inhibition of TASK-1 resulted in increases in firing rates across all photoperiods, suggesting that it contributes to setting excitability, but is not regulated by photoperiod. To examine if photoperiod impacts transcriptional regulation of TREK-1, we quantified Kcnk2 mRNA levels specifically in dorsal raphe 5-HT neurons using triple-label RNAscope. We found that Long photoperiod significantly reduced levels of Kcnk2 in serotonin neurons co-expressing Tph2 , and Pet-1 , Photoperiodic effects on the function and expression of TREK-1 were blocked in melatonin 1 receptor knockout (MT-1KO) mice, consistent with previous findings that MT-1 signaling is necessary for photoperiodic programming of dorsal raphe 5-HT neurons. Taken together these results indicate that photoperiodic regulation of TREK-1 expression and function plays a key role in photoperiodic programming the excitability of dorsal raphe 5-HT neurons.

Summary Spatial gene expression, achieved classically through in situ hybridization, is a fundamental tool for topographic phenotyping of cell types in the nervous system. Newly developed techniques allow for the visualization of multiple mRNAs at single-cell resolution, greatly expanding the ability to link gene expression to tissue topography. Yet, methods for efficient and accurate quantification and analysis of high dimensional in situ hybridization are limited. To this end, the Single-Cell Automated Multiplex Pipeline for RNA (SCAMPR) was developed, facilitating rapid and accurate segmentation of neuronal cell bodies using a dual immunohistochemistry-RNAscope protocol and quantification of low and high abundance mRNA signals using open-source image processing and automated segmentation tools. Proof of principle using SCAMPR focused on spatial mapping of gene expression by peripheral (vagal nodose) and central (visual cortex) neurons. The analytical effectiveness of SCAMPR is demonstrated by identifying the impact of early life stress on differential gene expression by vagal neuron subtypes. Motivation Quantitative analysis of spatial mRNA expression in neurons can lack accuracy and be both computationally and time intensive. Existing methods that rely on nuclear labeling (DAPI) to distinguish adjoining cells lack the precision to detect mRNA expression in the cytoplasm. In addition, quantification methods that rely on puncta counts can generate large, variable datasets that potentially undercount highly expressed mRNAs. To overcome these methodological barriers, we developed the SCAMPR pipeline that allows for fast, accurate segmentation of neuronal cell body boundaries, topographic gene expression mapping, and high dimensional quantification and analysis of mRNA expression in tissue sections.

Abstract Vagal sensory neurons located in the nodose ganglion provide a direct line of communication from the gut to the brain. Information, such as stomach stretch or the presence of ingested nutrients in the intestine, is conveyed to the caudal medulla via specialized cell types that express unique marker genes. Here, we leverage vagal cell type marker genes identified in adult mice to determine when specialized vagal subtypes arise developmentally, as well as the factors that shape their growth and target innervation. Initial sequencing and pathway analysis comparing early postnatal to adult nodose ganglia identified an enrichment of differentially expressed genes (DEGs) related to axon growth and guidance, synaptic strengthening, and DEGs downstream of brain derived neurotrophic factor (BDNF). Subsequent experiments performed to screen for trophic factor sensitivity revealed that both BDNF and glial cell derived neurotrophic factor (GDNF) robustly stimulate neurite outgrowth from early postnatal nodose ganglion explants in vitro . Anatomical examination of whole-body trophic factor expression in perinatal mice revealed that BDNF is expressed by neurons of the nodose ganglion itself, while GDNF is expressed by developing intestinal smooth muscle cells. Thus, BDNF may support vagal neurons as a locally derived trophic factor, while GDNF may act as a target derived trophic factor supporting the growth of vagal sensory processes at distal innervation sites in the gut. Consistent with this, expression of the GDNF receptor, Gfra1 , was enriched in vagal afferent cell types that project to the gastrointestinal tract. The BDNF receptor, Ntrk2, was expressed by the majority vagal sensory neurons, irrespective of cell type. Lastly, spatial mapping of genetic markers in the nodose ganglion demonstrates that defined vagal cell types begin to emerge as early as embryonic day 13, even as sensory neurons continue to grow to reach gastrointestinal targets. Despite the early onset of expression for some cell type marker genes, expression patterns of many individual cell type markers appear largely immature in prenatal life and mature considerably by the end of the first postnatal week. Together, the data support a role for GDNF in stimulating vagal sensory growth to gastrointestinal targets and establish a prolonged perinatal timeline for vagal sensory cell type maturation.

Summary The vagal motor nucleus ambiguus (nAmb) innervates the intrinsic muscles of the larynx, providing direct motor control over vocal production in humans and rodents. Here, we demonstrate that early developmental signaling through the MET receptor tyrosine kinase (MET) is required for proper formation of the nAmb. Embryonic deletion of Met in the developing brainstem resulted in a loss of one-third of motor neurons in the nAmb. While the remaining neurons were able to establish connections with target muscles in the larynx, advanced signal processing analyses revealed severe deficits in ultrasonic vocalization in early postnatal life. Abnormal vocalization patterns persisted into adulthood in the majority of mice tested. Interestingly, 28% of adult mice recovered the ability to vocalize demonstrating heterogeneity in circuit restitution. Together, the data establish MET as a factor necessary for development of a specific subset of neurons in the nAmb required for normal ultrasonic vocalization.

ABSTRACT Vagal afferent neuron (VAN) signaling sends information from the gut to the brain and is fundamental in the neural control of feeding behavior and metabolism. Recent findings reveal that VAN signaling also plays a critical role in cognitive processes, including hippocampus (HPC)-dependent memory. VANs, located in nodose ganglia, express receptors for various gut-derived endocrine signals, however, the function of these receptors with regards to feeding behavior, metabolism, and memory control is poorly understood. We hypothesized that VAN-mediated processes are influenced by ghrelin, a stomach-derived orexigenic hormone, via communication to its receptor (growth hormone secretagogue receptor [GHSR]) expressed on gut-innervating VANs. To examine this hypothesis, rats received nodose ganglia injections of an adeno-associated virus (AAV) expressing short hairpin RNAs targeting GHSR (or a control AAV) for RNA interference-mediated VAN-specific GHSR knockdown. Results reveal that VAN GHSR knockdown induced various feeding and metabolic disturbances, including increased meal frequency, impaired glucose tolerance, delayed gastric emptying, and increased body weight compared to controls. Additionally, VAN-specific GHSR knockdown impaired HPC-dependent episodic contextual memory and reduced HPC brain-derived neurotrophic factor expression, but did not affect anxiety-like behavior or levels of general activity. A functional role for endogenous VAN GHSR signaling was further confirmed by results revealing that VAN signaling is required for the hyperphagic effects of ghrelin administered at dark onset, and that gut-restricted ghrelin-induced increases in VAN firing rate require intact VAN GHSR expression. Collective results reveal that VAN GHSR signaling is required for both normal feeding and metabolic function as well as HPC-dependent memory.