Current knowledge of the mechanisms of cell migration is based on differentiated cells in culture where it is known that the actomyosin machinery drives migration via dynamic interactions with the extracellular matrix and adhesion complexes. However, unlike differentiated cells, cells in early metazoan embryos must also dynamically change cell sizes as they migrate. The relevance of cell size to cell migration and embryonic development is not known. Here we investigate this phenomena in zebrafish embryos, a model system in which reductive cell divisions causes cell sizes to decrease naturally over time as cells migrate collectively to sculpt the embryonic body plan. We show that cell size reduction during early development follows power-law scaling. Because mutations that can perturb cell sizes so early in development do not exist, we generate haploid and tetraploid zebrafish embryos and show that cell sizes in such embryos are smaller and larger than the diploid norm, respectively. Cells in embryos made of smaller or larger than normal cells migrate sub-optimally, leading to gastrulation defects. Multiple lines of evidence suggest that the observed defects originate from altered cell size rather than from pleotropic effects of altered ploidy. This interpretation is strengthened by the result wherein restoring cell sizes to normal diploid-like values rescues gastrulation defects. Live imaging of chimeric embryos where haploid/tetraploid cells are introduced into diploid embryos reveal the cell-autonomous nature of the migration defects. Additionally, aberrant intracellular actin dynamics with respect to the vectorial direction of motion suggests a cellular mechanism behind the migration defects. Taken together, early reductive cell divisions potentially allow dynamic, stage-specific cell size norms to emerge, which enables efficient collective cell migration to correctly position cells in space and time to shape an amorphous ball of blastoderm into an embryo.

Signaling pathways induce stereotyped transcriptional changes as stem cells progress into mature cell types during embryogenesis. Signaling perturbations are necessary to discover which genes are responsive or insensitive to pathway activity. However, gene regulation is additionally dependent on cell state-specific factors like chromatin modifications or transcription factor binding. Thus, transcriptional profiles need to be assayed in single cells to identify potentially multiple, distinct perturbation responses among heterogeneous cell states in an embryo. In perturbation studies, comparing heterogeneous transcriptional states among experimental conditions often requires samples to be collected over multiple independent experiments. Datasets produced in such complex experimental designs can be confounded by batch effects. We present Design-Aware Integration of Single Cell ExpEriments (DAISEE), a new algorithm that models perturbation responses in single-cell datasets with a complex experimental design. We demonstrate that DAISEE improves upon a previously available integrative non-negative matrix factorization framework, more efficiently separating perturbation responses from confounding variation. We use DAISEE to integrate newly collected single-cell RNA-sequencing datasets from 5-hour old zebrafish embryos expressing optimized photoswitchable MEK (psMEK), which globally activates the extracellular signal-regulated kinase (ERK), a signaling molecule involved in many cell specification events. psMEK drives some cells that are normally not exposed to ERK signals towards other wild type states and induces novel states expressing a mixture of transcriptional programs, including precociously activated endothelial genes. ERK signaling is therefore capable of introducing profoundly new gene expression states in developing embryos.

Abstract Haploid embryonic lethality is a common feature in vertebrates. However, the developmental defects and timing of lethality in haploid embryos differ between non-mammalian and mammalian species. Therefore, it remains unknown whether vertebrates share common principles of haploid intolerance. We investigated haploidy-linked defects at the cellular level in gynogenetic haploid zebrafish larvae that manifest characteristic morphogenetic abnormalities. Haploid larvae suffered severe mitotic arrest and irregular upregulation of p53, leading to unscheduled cell death. Either mitigation of mitotic arrest by spindle assembly checkpoint inactivation or depletion of p53 significantly improved organ growth in haploid larvae, indicating the critical contribution of these cellular defects to haploidy-linked morphogenetic defects. Moreover, haploid zebrafish larvae suffered frequent centrosome loss resulting in mitotic spindle monopolarization, a leading cause of mitotic instability in haploid mammalian cells (1, 2). Haploid larvae also suffered ciliopathy associated with severe centrosome loss. Based on our results, we propose the ploidy-linked alteration in centrosome number control as a common principle constraining the allowable ploidy state for normal development in vertebrates. Significance statement Haploid embryos possessing a single chromosome set are invariably lethal in vertebrates. Though haploid intolerance is attributed to imprinting misregulation in mammals, it remains unknown what limits the developmental capacity of haploid non-mammalian vertebrates free from the imprinting constraint. This study revealed the haploidy-linked mitotic misregulation and p53 upregulation as the leading cause of organ growth retardation in haploid zebrafish larvae. Accompanied by these defects, haploid larvae manifested drastic centrosome loss and mitotic spindle monopolarization, defects also limiting the proliferative capacity of haploid mammalian cells. These findings suggest the ploidy-linked alteration in centrosome number control as a common cell-intrinsic principle of haploid intolerance in vertebrates, providing an insight into an evolutionary constraint on allowable ploidy status in animal life cycles.