ABSTRACT Small RNA sequencing (sRNA-seq) has become important for studying regulatory mechanisms in many cellular processes. Data analysis remains challenging, mainly because each class of sRNA—such as miRNA, piRNA, tRNA- and rRNA-derived fragments (tRFs/rRFs)—needs special considerations. Analysis therefore involves complex workflows across multiple programming languages, which can produce research bottlenecks and transparency issues. To make analysis of sRNA more accessible and transparent we present seqpac: a tool for advanced group-based analysis of sRNA completely integrated in R. This opens advanced sRNA analysis for Windows users—from adaptor trimming to visualization. Seqpac provides a framework of functions for analyzing a PAC object, which contains 3 standardized tables: sample phenotypic information (P), sequence annotations (A), and a counts table with unique sequences across the experiment (C). By applying a sequence-based counting strategy that maintains the integrity of the fastq sequence, seqpac increases flexibility and transparency compared to other workflows. It also contains an innovative targeting system allowing sequence counts to be summarized and visualized across sample groups and sequence classifications. Reanalyzing published data, we show that seqpac’s fastq trimming performs equal to standard software outside R and demonstrate how sequence-based counting detects previously unreported bias. Applying seqpac to new experimental data, we discovered a novel rRF that was down-regulated by RNA pol I inhibition (anticancer treatment), and up-regulated in previously published data from tumor positive patients. Seqpac is available on github ( https://github.com/Danis102/seqpac ), runs on multiple platforms (Windows/Linux/Mac), and is provided with a step-by-step vignette on how to analyze sRNA-seq data.

ABSTRACT Small RNA (sRNA) sequencing has been critical for our understanding of many cellular processes, including gene regulation. Nonetheless, the varying biochemical properties of sRNA, such as 5’ nucleotide modifications, makes many sRNA subspecies incompatible with common protocols for sRNA sequencing. Here we describe 5XP-seq that outlines a novel strategy that solves this problem. By tagging 5’P sRNA during library preparation, 5XP-seq combines an open approach that includes all types of 5’-terminal modifications (5’X), with a selective approach for 5-phosphorylated sRNA (5’P). We show that 5XP-seq not only enriches phosphorylated miRNA and piRNA but successfully discriminates these sRNA from all other sRNA species. We further demonstrate the importance of this strategy by successful inter-species validation of sRNAs that would have otherwise failed, including human to insect translation of several tRNA (tRFs) and rRNA (rRFs) fragments. By combining 5’ insensitive library strategies with 5’ sensitive tagging, we have solved an intrinsic bias in modern sRNA sequencing that will help us reveal the true complexity and the evolutionary significance of the sRNA world.

Summary A wide spectrum of exogenous factors, including diet, environmental pollutants, stress, and seasonal changes have major impact on sperm quality and function. The molecular basis, however, that explains this susceptibility remains largely unknown. Using a combination of proteomics and small RNA (sRNA) sequencing, we show that Drosophila sperm display rapid molecular changes in response to dietary sugar, both in terms of metabolic/redox proteins and sRNA content, particularly miRNA and mitochondria derived sRNA (mt-sRNA). Thus, results from two independent omics point at the dynamics of mitochondria as the central aspect in rapid metabolic adjustments in sperm. Using specific stains and in vivo redox reporter flies, we show that diet indeed rapidly alters the production of mitochondrial derived reactive oxygen species (ROS). Quenching ROS via supplementation of N acetyl cysteine reduces diet-upregulated miRNA, but not mitochondrial-sRNA. Together, these results open new territories in our search for the mechanistic understanding of sperm health and disease. Highlights Diet rapidly changes the proteomic and sRNA profiles in sperm Diet sensitive sperm proteins are found in human infertility studies Sperm mitochondrial ROS levels are modulated by diet dme-miR-10 regulation is secondary to diet-induced ROS Diet, but not diet-induced ROS, alters the expression of mitochondrial small RNA, especially tsRNA

SUMMARY Early-life stress can generate persistent life-long effects that impact adult health and disease risk, but little is known of how such programming is established and maintained. Previous use of the Drosophila strain w m4h show that an early embryonic heat shock result in stable epigenetic alteration in the adult fly. To investigate the potential role of small non-coding RNA (sncRNA) in the initiation of such long-term epigenetic effects, we here generated a fine timeline of sncRNA expression during the first 5 stages of Drosophila embryogenesis in this strain. Building on this, we show that (1) miRNA is increased following early embryonic heat shock, and (2) the increased miRNA is coming from two separate sources, maternal and zygotic. By performing long RNA sequencing on the same single embryo, we found that a subgroup of miRNA with maternal origin, had a strong negative correlation with a group of early zygotic transcripts. Critically, we found evidence that one such early zygotic transcript, the insulator binding factor Elba1, is a Su(var) for w m4h . The findings provide insights of the dynamics and stress-sensitivity of sncRNA during the first embryonic stages in Drosophila and suggest an interplay between miRNA, Elba1 and long-term epigenetic alteration. HIGHLIGHTS We provide a high-resolution timeline for sncRNA for Drosophila stage 1-5 embryos Heat shock before midblastula transition (MBT) results in a massive upregulation of miRNA at cellularization Heat shock-induced miRNAs negatively associate with downregulation of a specific subset of pre-MBT genes Elba1 is a position-effect-variegation (PEV) modifier for w m4h Heat shock-induces an “leaky” expression of genes that overlap with Elba 1-3 binding sites